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TOP10F`化學感受態細胞

  • 產品貨號：CS-01F99218
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：340
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：10×100μl|50×100μl
  • 品牌名稱:莼試
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  • 分子量：

簡介內容：TOP10F`化學感受態細胞現貨供應，價格實惠。

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標簽:TOP10F`化學感受態細胞 10×100μl 50×100μl 

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TOP10F`化學感受態細胞

TOP10F′Chemically Competent Cell

10×100μl|50×100μl

CS-01F99218

TOP10F`菌株來源于TOP10菌株。

將F`{lacIq Tn10(TetR)}因子轉入TOP10菌株，即為TOP10F`。

該F`因子攜帶lacIq 抑制子，可抑制trc，tac，lac等啟動子下游基因的表達，從而可以用于一些表達毒性蛋白質粒的擴繁。

recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。

TOP10F可用于構建克隆，藍白斑篩選(如用于藍白斑篩選，需在培養基中加入IPTG誘導β-半乳糖苷酶基因的表達)實驗，具有四環素抗性。

TOP10F`感受態細胞經特殊工藝制作，經pUC19質粒檢測轉化效率>107cfu/μg。

保存條件：-80℃

基因型：

F'{lacIq Tn10(TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG

操作說明：

1.TOP10F`感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA(質粒或連接產物)并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養基(2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的2YT或LB培養基上。

5.將平板倒置放于37℃培養箱 12-16h，時間過長會產生假陽性小菌落。

注意事項：

1.感受態細胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。

2.混入質粒或連接產物時應輕柔操作。
3.轉化高濃度的質粒或高效率的連接產物可相應減少最終用于涂板的菌量。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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