產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
一步法逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(高含量ROX校正染料)	BaldStar TaqMan One Step RT-qPCR Kit(High ROX)	100次	CS-01F99180

本試劑盒是采用探針?lè)?/span>(TaqMan，Molecular Beacon等)進(jìn)行一步法Real-Time RT-qPCR的專用試劑盒。使用本產(chǎn)品進(jìn)行Real Time RT-qPCR反應(yīng)時(shí)，逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需添加試劑，無(wú)需打開(kāi)管蓋，避免了污染的同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)效率。本產(chǎn)品的檢測(cè)靈敏度高，熒光信號(hào)強(qiáng)，信噪比高，非常適合于RNA病毒等微量RNA的檢測(cè)。其所包含的特殊緩沖系統(tǒng)能使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶同時(shí)發(fā)揮最大功效，提高反應(yīng)效率。使用本產(chǎn)品可以得到更寬廣的線性范圍，對(duì)目的基因定量更準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可信度高。

注意事項(xiàng)：

1、本試劑盒中試劑使用前請(qǐng)上下顛倒輕輕混勻，盡量避免起泡，并經(jīng)短暫離心后使用。

2、本產(chǎn)品以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR實(shí)驗(yàn)，在操作過(guò)程中應(yīng)避免RNase污染，建議在專門的區(qū)域進(jìn)行RNA操作，使用專門的儀器和耗材，操作人員帶口罩和一次性手套并經(jīng)常更換手套，實(shí)驗(yàn)相關(guān)耗材應(yīng)用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃處理12小時(shí),并高壓滅菌30分鐘后使用。

3、本試劑盒中的各試劑應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

4、本試劑盒必須使用特異性引物，引物的選擇可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇，引物設(shè)計(jì)的好壞直接影響到RT-qPCR反應(yīng)的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物時(shí)需考慮GC含量，引物長(zhǎng)度，引物位置，PCR產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，建議采用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。

5、本試劑盒推薦使用特異性探針，建議采用專業(yè)的設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。

儲(chǔ)存條件：-20℃，避免反復(fù)凍融

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

在線咨詢

留言注意事項(xiàng)：

1.遵守中華人民共和國(guó)有關(guān)法律、法規(guī)，尊重網(wǎng)上道德，承擔(dān)一切因您的行為而直接或間接引起的法律責(zé)任。

2.請(qǐng)您真實(shí)的反映產(chǎn)品的情況,不要捏造、誣蔑、造謠。如對(duì)產(chǎn)品有任何疑問(wèn),也可以留言咨詢。

3.未經(jīng)本站同意，任何人不得利用本留言簿發(fā)布個(gè)人或團(tuán)體的具有廣告性質(zhì)的信息或類似言論。

您感興趣的產(chǎn)品*
您的單位*
聯(lián)系人*
聯(lián)系電話*
詳細(xì)地址*
常用郵箱*
請(qǐng)輸入您對(duì)我們的意見(jiàn)或建議*
驗(yàn)證碼*