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本品包含快速高保真DNA Polymerase、dNTPs和優化的反應緩沖液，濃度為2×。使用時只需加入模板、引物，并補足水至Mix終濃度為1×即可。所含聚合酶來自于基因工程改造的pfu，大大提高了擴增速度、保真性和產量。本產品是非長片段超保真快速擴增的首選產品。本制品含紅色示蹤染料，不需添加上樣緩沖液即可直接上樣進行電泳；也可經過純化處理，以用于酶切、連接、熒光測序等后續操作。

產品特點：

1. 擴增速度快：延伸速度可以達到2～4kb/min，是pfu的4～8倍。

2. 擴增產量高：一般PCR產物量比傳統pfu產量高50%-100%

3. 優異保真性：保真度是taq的54倍以上。一般隨機挑一個菌測序便是正確無突變落。

4. 擴增長度指標和pfu一致，可以完全替代pfu進行快速高保真擴增，但不建議用于pfu無法擴增的長片段。以復雜基因組DNA為模板適合擴增不超過3kb左右的產物，以簡單基因組、質粒和噬菌體DNA為模板適合擴增不超過6kb左右的產物。

注意事項

1.本系統擴增速度快，質粒和簡單基因組等簡單模版可采用15～20秒/kb,復雜模版如人類基因組可以采用30～45秒/kb。

2.對于GC含量很高的模版，預變性和變性溫度可以提高到98℃，本品聚合酶耐熱性強，98℃對聚合酶活性無影響。

3.如果擴增模板GC含量高或者模板復雜擴增效果不佳時，可在反應混合物中加入DMSO到終濃度1%～8%，按照1%梯度增加摸索最佳濃度。或者加入甜菜堿至終濃度1～1.7 M。并采用降落PCR(Touchdown PCR)。

儲存條件：-20℃，有效期24個月。
本制品別名：2×PCR MasterMix

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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