產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
長(zhǎng)片段DNA快速高保真PCR MasterMix(含紅色示蹤染料)	Fast&HiFi Long DNA PCR MasterMix	1ml\|5ml	CS-01F99172

本產(chǎn)品包含高速高保真長(zhǎng)片段DNA聚合酶、dNTPs和優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液，濃度為2×。使用時(shí)只需加入模板、引物，并補(bǔ)足水至Mix終濃度為1×即可。所含DNA聚合酶為多種采用最先進(jìn)基因工程改造而來的超保真酶添加延伸因子混合而成，極大的提高了擴(kuò)增長(zhǎng)度、擴(kuò)增速度、保真性和產(chǎn)量。本品是長(zhǎng)片段超保真快速擴(kuò)增的首選產(chǎn)品。本制品含紅色示蹤染料，不需添加上樣緩沖液即可直接上樣進(jìn)行電泳；也可經(jīng)過純化處理，以用于酶切、連接、熒光測(cè)序等后續(xù)操作。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 擴(kuò)增速度快：延伸速度可以達(dá)到3～4kb/min，是pfu的6～8倍。

2. 擴(kuò)增產(chǎn)量高：一般PCR產(chǎn)物量比傳統(tǒng)pfu產(chǎn)量高50%-100%。

3. 優(yōu)異保真性：保真度是taq的54倍以上。一般隨機(jī)挑一個(gè)菌測(cè)序便是正確無突變落。

4. 擴(kuò)增長(zhǎng)度長(zhǎng)：以復(fù)雜基因組DNA為模板適合擴(kuò)增不超過10kb左右的產(chǎn)物，以簡(jiǎn)單基因組、質(zhì)粒和噬菌體DNA為模板適合擴(kuò)增不超過15kb左右的產(chǎn)物。

注意事項(xiàng)

1. 本系統(tǒng)擴(kuò)增速度快，質(zhì)粒和簡(jiǎn)單基因組等簡(jiǎn)單模板可以采用10～15秒/kb，復(fù)雜模板如人類基因組可以采用20～25秒/kb。

2. 如果電泳發(fā)現(xiàn)主帶上下拖尾模糊現(xiàn)象，或者泳道出現(xiàn)從上樣孔拖下來的涂抹帶現(xiàn)象，一般提示延伸時(shí)間過長(zhǎng)，梯度縮短延伸時(shí)間（建議10～15秒/kb為梯度減少延伸時(shí)間）直到獲得滿意結(jié)果。

3. 對(duì)于GC含量很高的模板，預(yù)變性和變性溫度可以提高到98℃。本聚合酶耐熱性強(qiáng)，98℃對(duì)本聚合酶的活性無改變。

4. 如果擴(kuò)增模板GC含量高或者模板復(fù)雜擴(kuò)增效果不佳時(shí)，可在反應(yīng)混合物中加入DMSO到終濃度1%～8%，按照1%梯度增加摸索最佳濃度?；蛘呒尤胩鸩藟A至終濃度1～1.7 M。并采用降落PCR（Touchdown PCR）。

儲(chǔ)存條件：-20℃，有效期2年。
本制品別名：2×PCR MasterMix|長(zhǎng)片段PCR MasterMix|高保真PCR MasterMix

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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