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地高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)

  • 產品貨號：CS-01F99164
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：1盒
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：地高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)現貨供應，價格實惠。

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標簽:地高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD) 1盒 

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地高辛隨引物標記和檢測試劑盒Ⅰ(POD)

 

1盒

CS-01F99164

介紹

 

 保存條件：-20℃冰凍保存。

保存期：一年

用途：用于 DNA 探針的隨機引物標記及各種膜上雜交和原位雜交。

工作量：可用于標記0.1—3μg的探針 6次及 1000 張切片的原位雜交或12次 10×10cm 膜上雜交檢測。

原理：

所謂 DNA 探針，實質上是一段已知的基因片段，應用這一基因片段即可與待測樣品雜交。

如果靶基因和探針的核苷酸序列相同，就可按堿基配對原則進行核酸分子雜交，從而達到檢查樣品基因的目的。在隨機引物法標記反應液中，有隨機合成的六聚體核苷酸(hexanucleotide)作為引物，

dATP、dCTP、dGTP、dTTP和 D1G-11-dUTP 作為合成底物，以單鏈 DNA 作為模板，在 Klenow 酶的作用下，合成摻入地高辛的DNA 鏈。以地高辛標記的探針與靶基因DNA 鏈雜交后，再通過免疫反應來

進行檢測。一般通過酶標抗地高辛抗體來檢測，就可以肯定雜交反應的存在。

免疫檢測采用過氧化物酶系統，DAB 顯色。敏感性很高。可用于膜上雜交和原位雜交。特點：

(1)標記屬高效標記反應。以1μg DNA 探針為例，1 小時反應即可產生0.8μg 標記探針，20 小時可產生2μg 左右的標記探針。

(2)試劑將標記反應所需的引物、核苷酸、DIG-11dUTP和Klenow 酶等混合在一起。一次標記只需吸取一次標記液，使用至為簡便。

(3)標記反應適于下述對象：

a.DNA 從10ng—3μg。

b.不等的DNA 長度100bp—10kb。

c.線形排列或呈高度卷曲之DNA。

d.低融點瓊脂中的DNA。

(4)檢測系統抗體為抗地高辛單抗+SABC。抗地高辛單抗標記生物素，效價1：1000-2000(膜上雜交)或1：1000(原位雜交)。

(5)顯色劑為DAB，非常穩定。用時1：40 稀釋。

(6)試劑盒敏感性達到0.1pg，足夠檢測出1μg 基因組DNA 中的單個基因。
(7)除用于各種膜上雜交之外，還可用于原位雜交(ISH)。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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