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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒	Genomic DNA extraction kit for Gram-positive bacteria	50T\|100T	CS-01F99080

本試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統，提取革蘭氏陽性菌基因組DNA。離心吸附柱中采用的硅基質材料為本公司特有新型材料，能夠高效專一吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質量穩定可靠。使用本試劑盒提取的基因組DNA可用于各種常規操作，包括酶切、 PCR、文庫構建、Southern雜交等實驗。

儲存條件：15～25℃干燥保存，有效期12個月，2℃-8℃保存時間更長。

操作步驟：

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1．取細菌培養液1ml，12000rpm 離心1min.，盡量吸除上清。

2．向菌體中加入200μl終濃度為20mg/ml的溶菌酶，用溶菌酶干粉加入緩沖液20mM Tris(pH8.0)；2mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100，37℃處理30min以上。(如果需要去除RNA，可加入20μl RNase A,100mg/ml溶液)

3．向菌體中加入200μl溶液A，振蕩或用移液器吹打使菌體充分懸浮，向懸浮液中加入20μl的RNase A(10mg/ml)和50ul溶菌酶，充分顛倒混勻，室溫放置30～60min。(可選作，如做第3步操作，可以將第2步離心后的沉淀用于后續實驗)。

4．向管中加入20μl的蛋白酶K(10mg/ml)，充分混勻，55℃消化30～60min，消化期間可顛倒離心管混勻數次，直至樣品消化完全為止，此時可見菌液呈清亮粘稠狀。

5．向管中加入200μl溶液B，充分顛倒混勻，如出現白色沉淀，可于75℃放置15～30min，沉淀即會消失，不影響后續實驗。如果溶液未變清亮，說明樣品消化不徹底，可能會導致 DNA的提取量以及純度降低，還可能堵塞吸附柱。

6．向管中加入200μl無水乙醇，充分混勻，此時還可能會出現絮狀沉淀，不影響DNA的提取，可將溶液和絮狀沉淀都加入到吸附柱中，靜置2min。

7．12000rpm離心2min. 棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

8．向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前請先檢查是否己加入無水乙醇)。12000rpm 離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

9．向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000rpm離心lmin，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

10．12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續實驗如酶切、PCR等。

11．將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 50～200μl經65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，12000rpm離心1min。

12．離心所得洗脫液再加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm 離心2min，即可得到高質量的細菌基因組DNA。

注意事項:

1．樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。

2．若試劑盒中的溶液出現沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。

3．如果實驗中的離心步驟出現柱子堵塞的情況，可適當延長離心時間。

4．洗脫緩沖液的體積最好不少于50μl，體積過小會影響回收效率；洗脫液的pH值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調至此范圍)，pH值低于7.0會降低洗脫效率。DNA產物應保存在-20℃，以防DNA降解。
5．DNA濃度及純度檢測：得到的基因組DNA片段的大小與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。回收得到的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1.0相當于大約50μg/ml雙鏈DNA、40μg/ml單鏈DNA。OD260/0D280比值應為1.7～1.9，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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