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產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
磁珠法動物基因組DNA提取試劑盒(心、肝、肌)	Magnetic Animal Tissue Genomic DNA Kit	50T	CS-01F99079

本試劑盒采用具有獨特分離作用的磁珠和緩沖液系統(tǒng)，可從樣品中分離純化高質(zhì)量基因組DNA。特殊包被的磁珠在一定條件下對目的DNA具有很強的親和力，而當(dāng)條件改變時，磁珠釋放吸附的 DNA，能夠達到快速分離純化DNA 的目的。整個過程安全、便捷，提取的 DNA 純度高。使用本試劑盒純化的基因組 DNA 的 OD260/OD280均在 1.7-1.9 之間，可以應(yīng)用于各類下游分子生物學(xué)實驗。

儲存條件：磁珠可以在室溫下運輸，但請在4℃冰箱中保存，禁止凍存。其余試劑可以室溫保存，更長時間的保存可置于2-8℃。有效期1年。

操作步驟：

使用前請先在漂洗液中配置70%乙醇。若裂解液產(chǎn)生沉淀，使用前應(yīng)將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫放置一段時間，必要時可在 37℃水浴中預(yù)熱 10min 溶解沉淀，搖勻后使用。

1．裂解

取適量的動物組織樣本（肌肉組織≤50mg；心臟≤30mg；肝臟≤20mg）用液氮研磨成粉末，并迅速轉(zhuǎn)移到已加入600μl裂解液S1-2、40μl裂解液S2的EP管中，吹打或震蕩混合均勻。將EP管置于65℃水浴25～30min。待冷卻到室溫，加入400ul氯仿，劇烈震蕩15s，靜置3min，12000rpm 4℃離心5-10min。

2．結(jié)合

盡量取凈上清于新的1.5mL EP管中，加入等體積的異丙醇以及振蕩混勻的50μL磁珠，顛倒混勻1min，靜置3min。將EP管置于磁鐵上進行磁分離，吸棄廢液（吸凈管蓋及管底殘液）。

3．洗滌

加入600μL 漂洗液（使用前請預(yù)先配置70%乙醇），輕柔混勻1～2min，將EP管置于磁力架上進行磁分離，吸凈管蓋及管底的殘液；重復(fù)本步驟一次。

4．洗脫

室溫晾干5～10min至乙醇揮發(fā)完全，加入50～100μL洗脫液，緩慢抽吸混勻，65℃水浴10min（每隔1～2min輕搖EP管幾下混勻）。將EP管置于磁力架上進行磁分離，小心吸取上清液至新的EP管中，進行下游實驗。（判斷磁珠晾干的標(biāo)準(zhǔn)：側(cè)面觀察磁珠無反光，正面觀察磁珠邊緣龜裂）

注意事項：

1．動物組織（心、肝、肌肉）要用液氮充分研磨。

2．整個裂解過程操作盡量溫和，并在要求時間內(nèi)完成。

3．如果組織液濃度較高，則建議磁珠量可適當(dāng)增加，以獲取高濃度DNA。

4．客戶自備試劑：氯仿、異丙醇、無水乙醇。

5．使用前請在漂洗液瓶中預(yù)先配制 70%乙醇。
6．磁珠在使用前一定要充分混勻。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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