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本試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和獨特的緩沖液系統，能提取多種細胞/組織中的基因組DNA。離心吸附柱可以高效、專一吸附DNA，可最大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。提取的基因組DNA片段大，純度高，質量穩定可靠。使用本試劑盒回收的DNA可適用于各種常規操作，包括酶切、PCR、文庫構建、Southern雜交等實驗。

操作步驟：

如非指出，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。

1、處理材料：

a. 培養細胞：貼壁培養的細胞應先處理為細胞懸液(如用PBS緩沖液或類似緩沖液)，10,000 g離心1分鐘，倒盡上清，加入200μl緩沖液GA，振蕩至徹底懸浮。

b. 組織：取約30mg動物組織(脾組織用量應少于10 mg)加入到事先盛有200μl 緩沖液GA的1.5ml離心管中，用研磨杵徹底將組織研碎。

2、加入20μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取細胞基因組時，加入蛋白酶K混勻后，55℃放置5-10分鐘。

b. 提取組織基因組時，加入蛋白酶K混勻后，在55℃放置，直至組織溶解。

注：不同組織裂解時間不同，通常需1-3小時即可完成(鼠尾需要消化過夜),期間間歇顛倒混勻樣品。

3、加入10μl RNaseA(10 mg/ml)溶液，混勻后室溫放置2分鐘。

4、加入220μl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

注：加入緩沖液GB時可能會產生白色沉淀，一般70℃放置一段時間后會消失。如溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，會影響DNA的純度和得率，而且可能導致步驟6中離心柱堵塞。

5、加入220μl 無水乙醇，顛倒混勻，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

注：加入乙醇后會產生絮狀沉淀，可用槍頭反復抽打1-2次將沉淀弄碎后再上柱。如果絮狀物未做處理，容易導致步驟6中離心柱的堵塞。

6、將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CG中(吸附柱放入收集管中)，11000g離心2分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放回收集管中。

注：如果出現吸附柱堵塞現象，可將離心時間延長到5分鐘。

7、向吸附柱CG中加入500μl去蛋白液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

8、向吸附柱CG中加入700μl 漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000g離心1分鐘，倒掉廢液，吸附柱CG放入收集管中。

9、向吸附柱CG中加入500μl 漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000g離心1分鐘，倒掉廢液。

10、將吸附柱CG放回廢液收集管中，11000g離心2分鐘。

注：此步驟非常重要，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR等)實驗。

11、將吸附柱CG轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl經70℃水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘，11000g離心2分鐘。

注意：

a.洗脫緩沖液體積最好不少于100μl，體積過小影響回收效率。

b.洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5范圍內，pH值低于7.0會降低洗脫效率。

12、DNA產物-20℃保存。
儲存條件：室溫，有效期12個月。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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