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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒	Column Bacterial DNA Isolation Kit	50次	CS-01F99065

介紹

本產(chǎn)品是在在"百無憂"細(xì)菌DNA提取試劑盒基礎(chǔ)上開發(fā)的柱式升級產(chǎn)品，可以用于絕大多數(shù)革氏陽性和陰性細(xì)菌基因組DNA的快速提取。

特點：

1. 操作簡單，整個過程不到20分鐘。

2. 產(chǎn)率一般在5-20μg/mL 過液培養(yǎng)的飽和菌液（10^8～10^9個細(xì)胞）。

3. OD260/280一般在1.8以上，可直接用于PCR、酶切、雜交等實驗。

4. DNA片段長度一般在40-50 Kb左右。

5. 每次提取可以處理0.1-1.5mL的細(xì)菌，也可以使用菌落。

6. 價廉物美，與國外同類產(chǎn)品相比質(zhì)量相當(dāng)，但價格便宜。

7. 安全無毒，本試劑盒對人體無害，無腐蝕性和刺激性氣味。

保存條件：常溫(溶菌酶干粉需要4℃或-20℃保存)，有效期一年。

自備試劑：氯仿、自備無菌水

使用方法：

注意：溶液A和溶液B 容易產(chǎn)生沉淀，溶液B 十分粘稠，均需要放置在65℃預(yù)熱使沉淀溶解、粘稠度降低，用前充分搖勻。

一、對革氏陰性細(xì)菌樣品，不需用溶菌酶

1. 將0.1-1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中， 12,000rpm室溫離心1分鐘沉淀細(xì)菌，棄上清。

2. 加入300uL預(yù)熱的溶液A 到細(xì)菌沉淀中，充分吹打均勻。

3. 再加入150uL預(yù)熱的溶液B 到離心管中，顛倒數(shù)次混勻。此時溶液中可能有白色絲狀懸浮物產(chǎn)生。由于溶液B 比較粘稠，可以采取稱量方法取用，150μL約等于150-160 mg。也可以將1mL 槍頭剪去一截再吸取。

4. 65℃放置3-5分鐘。如果室溫放置，DNA 產(chǎn)量會降低10-20%。

5. 加入200μl 自備氯仿，震蕩混勻10-30 秒，此時溶液將呈乳白色。

6. 12,000rpm 室溫離心2分鐘。此時上清液將變得透明，中間層有白膜。小心轉(zhuǎn)移上清液到一個新的1.5mL 塑料離心管中，避免觸及中間層的白膜。

7. 加入1.5 倍體積(約0. 7mL)的溶液C，顛倒混勻后全部轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置至少2分鐘。

8. 12,000rpm 室溫離心1分鐘，DNA 將吸附在離心吸附柱的膜上，倒棄收集管中的穿透液。

9. 將0.5mL 通用洗柱液加入離心柱中，12,000rpm 室溫離心1分鐘，棄穿透液。

10. 重復(fù)上步操作一次。

11. 空甩半分鐘去除殘留液體,將離心吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5mL 離心管中。

12. 加50-100μl 通用洗脫液，室溫放置3-5分鐘。

13. 12,000rpm 室溫離心1分鐘即得DNA 溶液。

14. 由于本產(chǎn)品使用的離心吸附柱吸附DNA的能力較強(qiáng)，可以重復(fù)上步操作一次以便得到更多的DNA。
15. 直接取5-10μl 電泳檢測DNA，其余放冰箱備用。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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