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本試劑盒適用于從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中有效純化總DNA，包括基因組DNA和線粒體DNA。本品使用專門優(yōu)化的裂解液和蛋白酶K，釋放福爾馬林固定或組織切片樣本中的DNA，無需過夜操作；消化后的樣品在較高的溫度孵育后，去除由福爾馬林交聯(lián)造成的抑制作用，有效提高DNA的產量和純度；優(yōu)化的緩沖系統(tǒng)使裂解液中的DNA可特異結合到硅膠吸附膜上，而其他污染物可流過膜；PCR和酶反應的抑制劑以及殘留的雜質可通過兩步漂洗步驟有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度DNA。經過純化的DNA可以直接用于PCR、Real-time PCR、SNP基因分型、STR基因分型和藥物基因組學研究等。

自備試劑：無水乙醇、10mM PBS(PH7.4)(固定液中的組織)。

實驗前準備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。

2、獲得樣品后，要盡快將樣品在4%-10%的福爾馬林中固定，固定時間以14-24小時為宜，時間過長易導致基因組斷裂，影響下游實驗。

3、確保包埋前的樣品徹底脫水，殘留的福爾馬林會抑制蛋白酶K 的作用。

4、第一次使用前應按試劑瓶標簽說明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

5、使用前請檢查Buffer GTL和Buffer GL是否出現(xiàn)結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。

6、如果下游實驗對RNA污染比較敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本試劑盒并未提供，如果需要可單獨向本公司訂購，貨號：WE0225S。

操作步驟：

1、樣本處理：

a. 石蠟包埋樣本：用手術刀將組織塊中多余的石蠟修剪掉，露出組織。

b. 福爾馬林等固定液中的樣本：取約20 mg的樣本，切成小塊，置于離心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4),渦旋振蕩，12000rpm(～～13400×g)離心1分鐘，重復3次，可直接進行第7步操作。

2、將組織塊切成5-10μM的薄片。

注意：如果樣品表面已經暴露在空氣中，請將接觸空氣的2-3片棄掉不用。

3、取約1×1cm2的切片(共約4-5片切片)置于離心管(自備)中，加入1ml二甲苯，蓋緊管蓋，渦旋震蕩10秒。

4、12000rpm離心2分鐘，小心吸棄上清，注意不要吸棄沉淀。

5、加入1ml無水乙醇，渦旋震蕩混勻。12000rpm離心2分鐘，棄上清，注意不要吸棄沉淀。

注意：乙醇可以除去樣品中殘余的二甲苯。

6、打開管蓋，室溫或最高至37℃孵育10分鐘，直至無乙醇殘留。

7、加入180μl Buffer GTL，重懸沉淀；加入20μl 蛋白酶K ，渦旋震蕩混勻。

8、56℃孵育1小時，直至樣品完全溶解。90℃孵育1小時。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1)此步驟的目的是修復由甲醛變性的核酸，孵育的溫度過高或時間過長可能造成DNA斷裂，產生DNA碎片。

2)56℃孵育后的樣品可置于室溫，直至水浴鍋或干浴鍋溫度達到90℃后再把樣品置于90℃孵育。

3)如需除去RNA，可將樣品溫度降到室溫后，加入4μl濃度為100 mg/ml 的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

9、加入200μl Buffer GL，渦旋震蕩徹底混勻。加入200μl無水乙醇，渦旋震蕩徹底混勻。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1)加入Buffer GL和無水乙醇后要立即充分混勻。

2)如果需要對多個樣品進行操作，可以將Buffer GL和無水乙醇事先混勻后加樣。

10、將步驟9所得溶液全部加入已裝入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

11、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

12、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

13、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘以徹底晾干。

注意：這一步目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續(xù)酶促反應(酶切、PCR等)。

14、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入20-100μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實驗對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH值低于7.0時洗脫效率不高。

2)離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產量。

3)用另外的20-100μl Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產量。

4)如果要提高DNA的終濃度，可以將步驟14所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復步驟14；若洗脫體積小于100μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產量。如果DNA的量小于1μg，推薦用20μl Buffer GE或滅菌水洗脫。

5)因為保存在水中的DNA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。儲存條件：室溫(15～30℃)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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