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本試劑盒適用于從植物組織和植物干粉中提取總DNA，包括基因組DNA，線粒體DNA以及葉綠體DNA。本品可以處理多至100 mg的樣本，可純化獲得最大為50 kb的DNA，多數片段在20-30 kb之間。本試劑盒采用先進的硅膠膜技術和簡單的離心程序，無需乙醇沉淀，簡單快速地分離得到高純度的DNA，有效去除PCR和其他酶促反應的抑制劑。本品可以在1小時內完成總DNA的提取，純化得到的DNA可以直接用于酶切、 PCR、 Real-Time PCR、文庫構建、 Southern Blot、分子標記等下游實驗。

自備試劑：β-巰基乙醇、氯仿、無水乙醇。

注意事項：

1、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。

2、Buffer GP1在使用前請加入β-巰基乙醇，1ml Buffer GP1加1μl β-巰基乙醇。加入β-巰基乙醇的Buffer GP1室溫可保存1個月。

3、第一次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

4、使用前請檢查Buffer GP1和Buffer GP2是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GP1和Buffer GP2于65℃水浴重新溶解。

5、如果下游實驗對RNA污染比較敏感，可以在加入Buffer GP1孵育后，加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：WE0225S。

操作步驟：

1、取植物新鮮組織約100 mg或干重組織約20 mg，加入液氮充分研磨。

2、將研磨后的粉末收集到離心管(自備)中，加入700μl 65℃預熱的Buffer GP1(使用前在預熱的Buffer GP1中加入β-巰基乙醇，使其終濃度為0.1%)，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65℃水浴20分鐘，水浴過程中顛倒離心管混勻樣品數次。

注意：如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl濃度為100 mg/ml 的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

3、加入700μl 氯仿，充分混勻，12000rpm(～～13400×g)離心5分鐘。

4、小心將上層水相轉入一新的離心管(自備)中，加入700μl Buffer GP2，充分混勻。

5、將步驟4中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中。若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需進一步提高DNA純度，可重復步驟7.

8、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR 等)。

9、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-100μlBuffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實驗對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH值低于7.0時洗脫效率不高。

2)離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產量。

3)用另外的50-100μl Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產量。

4)如果要提高DNA的終濃度，可以將步驟9所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復步驟9；若洗脫體積小于100μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產量。如果DNA的量小于1μg，推薦用50μl Buffer GE或滅菌水洗脫。

5)因為保存在水中的DNA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。儲存條件：室溫(15～30℃)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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