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本試劑盒提供了一種快速、靈活的方法，適用于新鮮或冷凍全血(用檸檬酸鹽、EDTA或肝素等抗凝劑處理過的樣品)提取總DNA，包括基因組DNA和線粒體DNA。本品可以靈活處理0.1-20ml的全血，采用非離心柱的方法，無需使用苯酚、氯仿等有機溶劑，有效去除蛋白、色素、脂類及其它抑制性雜質污染。整個過程在一個管中操作，減少了污染及樣本混淆的風險。提取的DNA產量高、質量好，可直接用于PCR、熒光定量PCR、酶切和Southern Blot以及文庫構建等實驗。

保存條件：Buffer FG1 2～8℃，其他組分室溫(15～30℃)。

產品特點

1、純度高：提取的基因組DNA可直接用于下游PCR、熒光定量PCR、酶切等各種實驗。

2、提取量大：可從0.1-20ml的全血中提取DNA，無需使用苯酚、氯仿等有機溶劑。

3、兼容性強：適用于處理各種血液和細胞樣本。

自備試劑：異丙醇、70%乙醇

實驗前準備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K 中加入指定用量(0.3ml/1.25ml)的蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。

2、所有離心操作均在室溫下完成。

3、血液樣品反復凍融，會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。所得基因組DNA也應盡可能避免反復凍融，以免降解。如果提取冷凍血液的基因組DNA，建議37℃水浴，迅速解凍后再進行后續操作。

4、血液樣品的儲存：

1)短期保存：已加入抗凝劑的血液樣品可在2～8℃儲存最多10天，對于某些實驗例如Southern雜交等，需要得到完整全長的基因組DNA，請將血液樣品在2～8℃儲存不超過3天，此時基因組DNA的降解程度較輕。

2)長期保存：已加入抗凝劑的血液請置于-70℃保存(如果提取的是高分子量的DNA，推薦使用EDTA作為抗凝劑)。

操作步驟：

一、從100～900μl全血中提取基因組(以300μl血液處理量為例)

1、取300μl全血于2ml離心管(自備)中，加入300μl(樣本等體積)Buffer FG1，上下顛倒混勻5次，10000×g離心30秒，棄上清。

2、再向離心管中加入450μl(1.5倍樣本體積)Buffer FG1，渦旋震蕩，使沉淀完全分散。10000g離心30秒，棄上清，并把離心管倒置于干凈的吸水紙上，放置2分鐘。

注意：在極少情況下沉淀可能會松弛，所以要緩慢倒掉上清。將離心管倒置在吸水紙上，可以減少管壁上清的回流。

3、按照附表配制Buffer FG2與蛋白酶K 的混合液(比例100:1)。

注意：此混合液最好現用現配.井在配好后1小時之內用完。

4、加入150μl的Buffer FG2與蛋白酶K 的混合液，立即渦旋混勻至溶液無團塊。

注意：

1)如果有多個樣品同時操作，加入Buffer FG2/蛋白酶K 混合液后立即渦旋震蕩，不要等所有樣品部加完后再震蕩。

2)通常渦旋震蕩3-4次.毎次5秒，可以使沉淀充分懸浮，如果渦旋震蕩后發現沉淀中含膠狀物質可以再加入30μl的Buffer FG2/蛋白酶K 混合液，再次混旋混勻。

5、65℃孵育10分鐘，其間顛倒混勻數次。

注意：如果樣品顏色從紅色變成橄欖綠說明蛋白消化完全。

6、加入150μl導丙醇，上下顛倒徹底混勻直至出現絲狀或簇狀基因組DNA。

注意：與異丙醇完全混合對于沉淀DNA非常重要。如果樣品中白細胞含量少，可能看不到DNA，則至少上下頻倒高心管20次確保沉淀完全。

7、10000×g離心5分鐘。

注意：如果沉淀貼壁不牢，可以適當延長離心時間或増大離心力。

8、棄上清，并把離心管倒置于干凈的吸水紙上吸干。

注意：少數時候沉淀可能貼壁不牢，注意不要吸棄沉淀。

9、加入300μl的70%乙醇，渦旋震蕩5秒，10000×g離心5分鐘，棄上清。

注意：如果沉淀貼壁不牢，可以適當延長離心時間或増大離心力。

10、把離心管倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，確保沉淀在管中。

注意：在管底可見白色的DNA沉淀，在極少情況下沉淀可能會松弛，所以要緩慢倒掉上清。

11、空氣干燥DNA沉淀直至所有的液體揮發干凈(至少5分鐘)。

注意：乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、 PCR等)實驗，但避免過度干操DNA沉淀，因過度干燥會使DNA難于溶解。

12、加入200lμl的Buffer GE，低速渦旋5秒，65℃孵育1小時溶解DNA，期間輕彈數次助溶。-20℃保存DNA。注意：如果DNA沒有完全溶解，可室溫過夜。如果使用少量的FG3溶解DNA，建議延長孵育時間。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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