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本試劑盒適用于從酵母樣品中提取高純度的總DNA，本品無需使用苯酚、氯仿等有機溶劑抽提，可獲得最大為50 kb的DNA，同時對100 bp的DNA片段也能有效的回收。本試劑盒采用優化的緩沖液體系使裂解液中的DNA高效結合在硅膠膜上，而其他污染物可流過膜，使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度的DNA。提取的DNA可直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構建、Southern Blot、分子標記等下游實驗。

保存條件：Lyticase -20℃，其他組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：無水乙醇，β-巰基乙醇。

產品特點

1、適用于從酵母樣品中分離純化高純度總DNA。

2、無需有機溶劑提取以及乙醇沉淀，徹底去除污染物及下游反應抑制物，快速提取高品質DNA。

3、Lyticase酶與玻璃珠共同作用，有效破除酵母細胞壁。

實驗前準備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。

2、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。對于有些細胞壁較厚以及在培養階段會產生大量代謝物的酵母，建議在生長早期收集樣品。

3、Lyticase Working Buffer在使用前請加入β-巰基乙醇，使其終濃度為0.1%。

4、第一次使用前應按照試劑瓶標簽說明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

5、使用前請檢查Buffer GTL和Buffer GL是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GTL和Buffer GL于65℃水浴重新溶解。

6、如果下游實驗對RNA污染比較敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：WE0225S。

操作步驟：

1、取1-5ml酵母培養物(最多不超過5×107個細胞，一般對于釀酒酵母OD600=1.0時，相當于1-2×107細胞/ml)，12000rpm(～13400×g)離心1分鐘，收集菌體沉淀，盡量吸棄上清。

注意：菌液較多時，可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。

2、酵母細胞壁的去除：向菌體中加入600μl Lyticase Working Buffer(使用前檢查是否加入β-巰基乙醇，使其終濃度為0.1%)，并加入5μl Lyticase，充分混勻。30℃處理30分鐘。4000rpm(~1,500×g)離心10分鐘，棄上清，收集沉淀。

注意：以上為5×107酵母細胞Lyticase用量，根據酵母的菌株和酵母細胞數量的不同，所用的Lyticase的濃度和孵育時間應該進行適當調整。

3、向沉淀中加入200μl Buffer GTL，加入40 mg玻璃珠(Glass Beads)，渦旋5分鐘。

4、加入20μl 蛋白酶K 混勻。55℃振蕩水浴至細胞完全裂解。若無振蕩水浴箱，溫育期間每20-30分鐘顛倒混勻一次。(一般不超過1小時細胞即可完全裂解)。

注意：如需去除RNA，在上述步驟完成后加入4μl 100 mg/ml 的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

5、12000rpm離心5分鐘，小心吸取上清至新離心管中。

6、加入200μl Buffer GL，充分混勻。70℃孵育10分鐘，其間顛倒混勻數次，12000rpm離心5分鐘，將上清移到一個新的離心管中。

注意：若孵育后溶液未變清亮，說明細胞裂解不徹底，可能導致提取DNA量少和提取的DNA不純。

7、加入200μl無水乙醇，充分顛倒混勻，此時可能會出現絮狀沉淀。短暫離心，使管壁和管蓋上的液體集中到管底。

8、將步驟7所得溶液和沉淀全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

9、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需進一步提高DNA純度，可重復步驟10。

11、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘以徹底晾干。

12、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μl Buffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實驗對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH值低于7.0時洗脫效率不高。

2)離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產量。

3)用另外的50-200μl Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產量。

4)如果要提高DNA的終濃度，可以將步驟10所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復步驟10；若洗脫體積小于200μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產量。如果DNA的量小于1μg，推薦用50μl Buffer GE或滅菌水洗脫。

5)因為保存在水中的DNA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。
儲存條件：室溫(15～30℃)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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