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本試劑盒適合于從新鮮或冷凍的動物組織、細(xì)胞、血液、細(xì)菌等多種樣品中提取高純度總DNA。本品可純化獲得分子量最大為50 kb的DNA片段，純化過程不需使用苯酚或氯仿等有毒溶劑，無需乙醇沉淀。本試劑盒采用優(yōu)化的緩沖體系使裂解液中的DNA高效特異的結(jié)合到硅基質(zhì)離心吸附柱上，PCR和其他酶促反應(yīng)的抑制劑可通過兩步洗滌步驟被有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可得到高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構(gòu)建、Southern Blot、分子標(biāo)記等下游實驗。

自備試劑：無水乙醇，Enzymatic Lysis Buffer(提取革蘭氏陽性菌基因組DNA時須準(zhǔn)備)。

Enzymatic Lysis Buffe配方：20 mM Tris，pH8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；終濃度為20 mg/ml的Lysozyme(溶菌酶)。

實驗前準(zhǔn)備及重要注意事項：

1．向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml|4.5ml)的蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復(fù)凍融，以免影響其活性。

2、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致提取的DNA片段較小且提取量下降。

3、如果提取次生代謝產(chǎn)物大量積累或細(xì)胞壁厚的細(xì)菌培養(yǎng)物的基因組，建議在對數(shù)生長期早期收集樣品。

4、第一次使用前應(yīng)按試劑瓶標(biāo)簽的說明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

5、使用前請檢查Buffer GTL和Buffer GL是否出現(xiàn)結(jié)晶或者沉淀，如有結(jié)晶或者沉淀，請將Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。

6、如果下游實驗對RNA污染比較敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A 本試劑盒并未提供，如需要可單獨向本公司訂購，貨號：WE0225S。

操作步驟：

一、血液及細(xì)胞樣本基因組提取：

1、材料處理

a. 如果提取材料為哺乳動物抗凝血液(無核紅細(xì)胞)，可直接向50-200μl新鮮或冷凍的抗凝血液樣品中加入Buffer GTL補足至200μl；

b. 如果提取材料為禽類、鳥類、兩棲類或更低級生物的抗凝血液，其紅細(xì)胞為有核細(xì)胞，取5-10μl新鮮或冷凍的抗凝血液樣品，加入Buffer GTL補足至200μl；

c. 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)先處理為細(xì)胞懸液(最大提取量為5×106個細(xì)胞)，2000rpm(400×g)離心5分鐘，棄盡上清，加200μl GTL，振蕩至樣品徹底懸浮；注意：如需去除RNA，可在上述步驟完成后，加入4μl濃度為100 mg/ml的RNase A溶液，渦旋15秒，室溫放置2分鐘。

2、加入20μl 蛋白酶K 。

3、加入200μl Buffer GL，渦旋震蕩充分混勻，56℃水浴10分鐘。

4、短暫離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。加入200μl無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻，短暫離心。

注意：

1)加入Buffer GL和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。

2)加入Buffer GL和無水乙醇后可能會產(chǎn)生白色沉淀，不會影響后續(xù)實驗。一些組織在加入Buffer GL和無水乙醇后可能形成溶膠狀產(chǎn)物，此時推薦進(jìn)行劇烈震蕩或渦旋處理。

5、上一個步驟中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm(～～13400 ×g)離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟7。

8、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中廢液。將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)。

9、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μlBuffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實驗對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH將水的pH值調(diào)到此范圍)，pH值低于7.0時洗脫效率不高。

2)Buffer GE在65-70℃水浴預(yù)熱，離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產(chǎn)量；用另外的50-200μl Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產(chǎn)量。

3)如果要提高DNA的終濃度，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘；若洗脫體積小于200μl，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產(chǎn)量。如果DNA的量小于1μg，推薦用50μl Buffer GE或滅菌水洗脫。
4)因為保存在水中的DNA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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