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本試劑盒提供了一種簡單、快速、高效的血液DNA提取方法，適用于從新鮮或冷凍抗凝血(檸檬酸鹽、EDTA、肝素處理過的血液樣品)中提取血液DNA。在離液鹽存在時，DNA結(jié)合于硅基包被的Magbeads表面。經(jīng)兩步漂洗以及一步快速漂洗(MW3的快速漂洗對于提高DNA純度有很大幫助)后，高純度的DNA被洗脫于EB或去離子水中。DNA得率與樣品的類型，儲存條件、時間以及樣品中白細(xì)胞的含量有很大關(guān)系。純化得到的DNA純度好(260/280的比值在1.7-1.9之間，260/230的比值大于1.5)，完整度高(最高可達(dá)50 kb)，可用于克隆，定量PCR，芯片測序等下游反應(yīng)。

自備儀器及試劑：

1、手動單管操提取：

1)恒溫混勻儀

2)2/15ml磁力架

3)異丙醇、無水乙醇

2、手動96孔深孔板提取：

1)恒溫混勻儀

2)廢液抽吸系統(tǒng)

3)手動連續(xù)分液器

4)電動連續(xù)分液器

5)手動連續(xù)分液器分液管(25ml)

6)96孔深孔板磁力架

7)異丙醇、無水乙醇

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

1、向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml/25mg)的蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配置好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復(fù)凍融，以免影響其活性。

2、異丙醇與Magbeads混合物的制備(以制備提取10個樣品所需量為例)

1)向合適容量(加入異丙醇和Magbeads后總體積小于離心管容積的2/3)的離心管中加入3.3ml【0.3×(10+1)=3.3】的異丙醇。

注意：如用移液器加入異丙醇，需用移液器將槍頭在異丙醇吹吸兩次后再緩慢吸取異丙醇。

2)向上一步的離心管中加入220μl【20×(10+1)=220】Magbeads

注意：Magbeads加入前需渦旋振蕩20秒使其充分混勻，異丙醇與Magbeads混合物使用前需渦旋振蕩20秒鐘使其成為均一的溶液。

3)異丙醇與Magbeads混合物使用前需渦旋振蕩10秒鐘使其成為均一的溶液。

3、Magbeads嚴(yán)禁冰凍、離心。冰凍、離心可能會對Magbeads造成不可逆的損害。

4、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會導(dǎo)致提取得到的DNA片段較小且提取得率低。

5、次使用前應(yīng)按試劑瓶標(biāo)簽在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇并做好標(biāo)記。

6、如Buffer ML中出現(xiàn)沉淀，請?jiān)?/span>56℃水浴鍋中重新溶解，搖勻后即可使用。
7、實(shí)驗(yàn)過程中，磁珠在溶液中的充分混勻?qū)τ谔崛〉牡寐逝c純度都有很大的影響。實(shí)驗(yàn)過程中務(wù)必使磁珠與溶液充分混勻。不同廠家生產(chǎn)的恒溫混勻儀震蕩混勻效果有一定差異，實(shí)驗(yàn)過程中請注意觀察磁珠狀態(tài)。如出現(xiàn)磁珠貼壁等未充分混勻的現(xiàn)象，請用移液器吹吸混勻或調(diào)整震蕩頻率。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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