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本試劑盒提供了一種簡單、快速、高效的口腔拭子DNA提取方法，適用于從干燥保存或在保護液中保存的口腔拭子中提取基因組DNA。在高鹽存在時，DNA結合于硅基包被的Magbeads表面。漂洗后，高純度的DNA被洗脫于Buffer EB或去離子水中。純化得到的DNA純度好(A260/280的比值在1.7-1.9之間)，完整度高(>15 kb)，可用于二代測序、定量PCR、芯片檢測等下游實驗。

自備儀器及試劑：

1、手動單管操提取：

1)恒溫混勻儀

2)2/15ml磁力架

3)異丙醇、無水乙醇

2、手動96孔深孔板提取：

1)恒溫混勻儀

2)廢液抽吸系統

3)手動連續分液器

4)電動連續分液器

5)手動連續分液器分液管

6)96孔深孔板磁力架

7)異丙醇、無水乙醇

實驗前準備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K 中加入指定用量(1.25ml/25mg)的蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配置好的蛋白酶K 勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。

2、Magbeads嚴禁冰凍、離心。冰凍和離心可能會對Magbeads造成不可逆的損害。

3、Magbeads使用前需渦旋震蕩20秒使其充分混勻。

4、首次使用前應按試劑瓶標簽在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇并做好標記。
5、實驗過程中，磁珠在溶液中的充分混勻對于提取的得率與純度都有很大的影響。實驗過程中務必使磁珠與溶液充分混勻。不同廠家生產的恒溫混勻儀震蕩混勻效果有一定差異，實驗過程中請注意觀察磁珠狀態。如出現磁珠貼壁等未充分混勻的現象，請用移液器吹吸混勻或調整震蕩頻率

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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