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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
M13噬菌體單鏈DNA提取試劑盒	M13 phage single strand genomic DNA rapid extraction kit	50次\|100次\|200次	CS-01F99036

M13和其它的絲狀噬菌體載體，在文庫構建和為序列測序提供單鏈DNA和引人突變方面十分有用。將適量M13絲狀噬菌體或者相關噬粒（M13來源）感染的液體培養物離心，上清中的單鏈噬菌體DNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，將鹽、細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈噬菌體單鏈DNA從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

節省時間，簡捷，單個樣品操作一般可在10分鐘內完成。

產量高，典型的產量800μL M13絲狀噬菌體上清可以提取3μg噬菌體單鏈DNA。

多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9。可以直接用來測序，一般典型可辨認讀長達650bp。

保存事項：

本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。

結合液MB低溫時可能出現析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復澄清透明后冷卻到室溫即可使用。

避免試劑長時間暴露于空氣中產生揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

注意事項：

所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

開始實驗前將需要的水浴先預熱到50℃備用。

結合液MB含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

操作步驟：

以800μL噬菌體感染細菌培養上清提取舉例，第一次使用前請先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入！

將M13絲狀噬菌體或者相關噬粒（M13來源）感染的液體培養物分裝在1.5毫升離心管，12000rpm離心5分鐘沉淀菌體。

小心取800μL上清轉入新的1.5mL離心管，加入400μL結合液MB，充分混勻。

注：如果使用的上清大于或者小于800μL，則結合液MB的用量需要按照比例增加或者減少。

將上述混合物加入一個吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm離心15秒，倒掉收集管中的廢液。

注：吸附柱一次最多只可以容納大約700μL混合物，因此需要分次把混合物加到吸附柱內，重復步驟3。

加入600μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12000rpm離心30秒，棄廢液。

將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加60μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在50℃水浴中預熱），室溫放置1分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果想得到較多量的DNA，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，10000rpm離心1分鐘。

注：洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是最小體積不應少于40μL，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產量。

DNA可以存放在2～8℃，如果要長時間存放，可以放置在-20℃。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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