產(chǎn)品目錄

本試劑盒采用獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。本試劑盒適用于快速提取各種魚類、蝦類、扇貝等組織基因組DNA。

注意事項(xiàng)：

洗脫液EB 不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH 大于7.5， pH 過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA 應(yīng)該保存在－20℃。DNA 如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE 緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mMEDTA，pH 8.0），但是EDTA 可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB 中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1. 切取不多于30mg 的組織材料，放入裝有180μl 組織裂解液SL 的1.5ml 離心管中，渦旋振蕩15 秒。

根據(jù)提取的組織不同，起始量也稍有不同，腮的細(xì)胞量較大，一般建議提取量不超過(guò)20mg。如果裂解困難，可先用液氮研磨。

2. 加入20μl 的蛋白酶K 溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。將裂解物放置在55℃水浴1-3 小時(shí)或者直到組織消化完全。

不同組織裂解時(shí)間不同，通常需0.5–2小時(shí)即可完成。扇貝組織0.5小時(shí)基本可裂解完全，蝦和魚類組織1小時(shí)。每小時(shí)振蕩混合樣品2-3次，每次振蕩混勻15秒。

可選做步驟: 如果RNA 殘留較多，需要去除RNA，可在完成步驟2 后加20μlRNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10 分鐘。

3. 加入200μl 結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鐘。

4. 冷卻后加100μl 異丙醇，充分顛倒或渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

5. 將上一步混合物和可能的沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC 中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm 離心60 秒，倒掉收集管中的廢液。

如果有不溶組織物可能堵住槍頭，可將槍頭在吸水紙上輕蹭去除不溶物；如果吸上來(lái)的混合物少則可以將槍頭和不溶物一起棄去，該做法是為了去除不溶物，以免堵塞離心柱。

上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。

6. 加入500μl 抑制物去除液IR，12000rpm 離心30 秒，棄廢液。

7. 加入700μl 漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8. 加入500μl 漂洗液WB，12000rpm 離心30 秒，棄掉廢液。

9. 將吸附柱AC 放回空收集管中，13,000rpm 離心2 分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

10. 取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl 洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好），室溫放置3-5 分鐘，12000rpm 離心1 分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2 分鐘，12000rpm 離心1 分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積，但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

11. DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。
儲(chǔ)存條件：室溫，有效期12個(gè)月。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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