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痰液DNA提取試劑盒

  • 產品貨號：CS-01F99026
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：50次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：痰液DNA提取試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:痰液DNA提取試劑盒 50次 

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痰液DNA提取試劑盒

Sputum DNA extraction kit

50次

CS-01F99026

介紹

 

 痰液是重要的檢測樣品，可以用于診斷肺癌，肺結核等各種疾病。但是從痰液中純化DNA十分棘手，為此本公司開發了本產品，專用于從痰液或其他上呼吸道分泌樣品中純化DNA，用于后續的分子生物學分析。

產品特點：

1. 每次可以處理10-20mL痰液，得到2-5μg DNA。

2. 純度高,可直接用于后續得PCR檢測。

3.一管式操作，減少污染，節約成本。

4.含痰液保存液(溶液A)，便于取樣和運輸。

5. 無毒環保，不需要使用苯酚和氯仿等有毒的有機溶液。

儲存條件：常溫運輸和保存，有效期一年。

使用方法：

一：痰標本的獲取與保存(注意：痰液以及下列操作的廢棄液都可能含有致病性的結核桿菌等致病菌，需按傳染源相關規定流程進行操作)

1. 每例患者在常規痰標本采樣時，最好連續三天采集三次樣品以防誤差。具體做法是先在每個50mL的痰液收集管內新鮮加入10mL溶液A和10mL溶液B，待患者晨起漱口后，咳深部痰7～8口(約10-20mL)，收集到裝有溶液A和溶液B混合液的痰液管收集內，混勻后儲于4℃冰箱或陰涼處。第二、三天重復此操作。取足三管后一起送實驗室，4℃冰箱保存直到使用。

2. 使用時，在室溫反復振搖裝有樣品(總體積約30-40mL)的痰液收集管5～10分鐘，充分混勻直到痰液中無粘稠痰塊而呈均勻的液相。

3. 4℃2500g離心5分鐘，棄上清。

4.沉淀再用自備的PBS液洗兩遍。

5. 所得沉淀可以直接用于涂片，用于比較細胞形態學分析。也可以將細胞沉淀在0.2mL PBS緩沖液中重懸后轉入1.5mL螺旋蓋塑料離心管，-20℃冰箱長期保存，或立即用于下步的DNA提取。為避免蓋子崩開而出現交叉污染或痰液的分枝桿菌污染環境，建議不要使用壓蓋式塑料離心管。同時最好設置一個陽性和一個陰性對照。

二：DNA提取

6.在上步所得的0.2mL樣品中加入0.6mL溶液C。溶液C容易形成沉淀，用前需37℃加熱融化并搖晃均勻。

7.室溫放置10分鐘。此間可以在每個管外壁上做個標記，以在下步區別向心面和離心面。

8. 振蕩數秒后加入0.7mL自備的異丙醇，旋緊蓋后振蕩30秒混勻。

9. 把離心管的向心面對向轉頭，13,000-15000g室溫離心至少15分鐘。

10.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的DNA沉淀(此時可能看不見)。

11. 加入1.0mL 70%乙醇，振蕩數秒后 15000g室溫離心5分鐘。注意：在離心機中放置離心管時將其向心面對向轉頭的中央。

12.小心移棄上清，注意不要觸及管底和管壁離心面的DNA沉淀(此時呈膜狀沉淀)。

13. 將離心管放回離心機再短暫離心數秒，然后用移液器移棄約50μL殘留液體(70%乙醇)，否則它會影響后續反應。

14. 加入200μl RNase-free水，用移液槍仔細吹打離心管管底和管壁離心面的膜狀DNA沉淀，溶液將呈混濁狀，含少量不溶，短暫離心后存上清(含DNA)。
15. 直接取適量用于PCR，樣品使用量不超過PCR體系的1/2。剩余DNA樣品可以室溫放置2小時，也可保存于-80℃保存一個月。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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