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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
柱式骨骼DNA提取試劑盒	Bone DNA column extraction kit	50次	CS-01F99021

介紹

本試劑盒專門用于從動(dòng)物骨骼(包括骨粉)樣品中提取DNA的產(chǎn)品，20次規(guī)格足夠50次微量提取。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

微量提取，一次可以處理300mg左右的骨骼(但需要先將骨骼變成骨粉)。

柱式操作，方法簡單，整個(gè)過程只需要40～60分鐘。

得到的DNA分子量不均勻，一般在20kb到100bp之間，具體取決于骨骼的新鮮程度，骨粉的加工方法等。

得到的DNA可以直接用于PCR或熒光PCR反應(yīng)。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

骨粉的制備：用自備酒精將骨骼表面擦洗干凈，以防污染物對后續(xù)PCR的影響，然后用骨鉆在處理干凈的骨骼區(qū)域鉆取骨粉。對于已經(jīng)制備好的、商品化的骨粉，可以跳過此步，直接進(jìn)入下一步。

用天平稱取0.2克骨粉，轉(zhuǎn)移到2mL塑料離心管中。

加入1mL溶液A到骨粉中，充分振蕩30秒混勻。

注意：溶液A在4℃放置后可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前必須放在65℃水浴使沉淀徹底溶解并充分搖勻后再取用，且骨粉加到溶液A中后會(huì)特別黏稠，需使勁振蕩混勻。

65℃水浴放置30分鐘。

加入0.3mL的溶液B和0.2mL的自備氯仿，充分振蕩30秒混勻。

12000rpm室溫離心3分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的塑料離心管中。

加入0.5mL溶液C，顛倒混勻。

將混合液分兩次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，每次轉(zhuǎn)移后需要12000rpm室溫離心1分鐘，并棄收集管中的穿透液。

加入0.5mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄收集管中穿透液。

再加入0.5mL通用洗柱液到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心1分鐘，棄收集管中穿透液。

12000rpm室溫離心半分鐘，棄含穿透液的收集管。此步干甩十分重要，否則殘留的液體會(huì)抑制后續(xù)的PCR。

將離心吸附柱套入到一個(gè)自備的干凈的1.5mL塑料離心管中，在離心吸附柱的濾膜的中部加入30μL DNA洗脫液，然后室溫放置2分鐘。如果先將DNA洗脫液預(yù)熱到60～80℃再使用，效果更佳。

12000～15000g室溫離心1分鐘，離心管中收集的樣品即為骨骼DNA。

取少量進(jìn)行電泳檢測。

注意：一般DNA都呈現(xiàn)彌散狀，分布在20kb～100bp這一廣泛的范圍，其比例跟骨骼(或骨粉)的新鮮程度、加工過程(對骨粉)等因素密切相關(guān)。
DNA樣品可以直接用于PCR，也可放-20℃長期保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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