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產(chǎn)品屬性：

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
柱式毛發(fā)DNA提取試劑盒	Hair DNA column extraction kit	50次	CS-01F99018

動物毛發(fā)不容易降解，同時含有大量的線粒體，所以是考古研究、法醫(yī)研究和線粒體研究等領(lǐng)域的重要性實驗材料。目前市場上專門用于毛發(fā)樣品DNA提取的產(chǎn)品很少，為此我們研發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點：

1.充分的酶法降解和快速的柱式提取相結(jié)合，前者使DNA充分釋放，后者使雜質(zhì)充分被去除。

2.DNA回收率一般在0.5μg/100mg左右(理論產(chǎn)率一般是0.1-1.5μg之間)。

3.DNA純度高，OD比值一般在1.6-1.8之間。

4.提取的DNA能夠用于電泳、酶切、雜交檢測和PCR。

5.適合于動物的各種毛發(fā)。

儲存條件：常溫運輸及保存(蛋白酶K溶液需要-20℃保存)，有效期一年。

使用方法：

1.將30-50mg左右毛發(fā)充分剪碎(成芝麻大小就可以)，最后轉(zhuǎn)移到一個干凈的1.5mL塑料離心管中。注意：最好從靠近根部的地方剪取樣品。

2.加入1mL溶液A(使用之前需取本次實驗所需的溶液A現(xiàn)加入自備的β-巰基乙醇，β-巰基乙醇的終濃度為5%)和20μL蛋白酶K溶液(20mg/mL)，37℃保溫10小時(一般過夜保溫就可以)。

注意：最好讓反應(yīng)體系處于搖晃狀態(tài)，此保溫長度一般可以讓毛發(fā)溶化。

3.加入0.3mL的溶液B和0.2mL的自備氯仿，振蕩器上振蕩30秒充分混勻。

4.12000rpm室溫離心3分鐘，小心將上清轉(zhuǎn)移到新的1.5mL塑料離心管中。

5.在上清液中加入等體積的溶液C，上下顛倒30秒充分混勻。

6.將混合液分兩次轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。每次是先將0.7-0.8mL混合液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12000rpm室溫1分鐘，棄穿透液。再把剩余的一半上柱，重復(fù)此操作。

7.將0.7mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。

8.將0.3mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000rpm離心半分鐘(此步為第二次洗滌，一般可以省略)。

9.空甩離心吸附柱半分鐘去除殘留液體。

10.將離心吸附柱放置在一新的1.5mL塑料離心管中，加入30μL通用洗脫液。

11.12000rpm離心1分鐘，管底即為毛發(fā)DNA溶液，可立即用于PCR，也可長期保存在－20℃。
注意：由于頭發(fā)中DNA的含量十分少，所以電泳檢測時即使全部上樣也只能看見十分微弱的DNA條帶。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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