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1. 勻漿方法一：稱取0.1-0.3g軟體動物組織，轉移到塑料研缽中，液氮研磨成粉后轉移到一個干凈的1.5mL塑料離心管中。注意：最好避免使用含二氧化硅的玻璃研缽，因為DNA 會吸附在表面，影響得率。在離心管中加入1mL 65℃預熱的溶液A并用移液槍頭充分吹打混勻(如果溶液A有沉淀，需先在65℃加熱溶解后搖勻再使用)。進入第三步。

2. 勻漿方法二：將0.1-0.3g軟體動物組織剪成小塊，轉移到10-15mL塑料管中(培養細菌那種離心管即可)，加入1mL 65℃預熱的溶液A，用Polytron 式勻漿機(剪切式勻漿機)勻漿1分鐘左右。

3. 65℃保溫5-30分鐘，其間最好吹打混勻2-3次。

4.轉移到新的1.5mL離心管中，12000～15000g室溫離心3分鐘。

5. 將不超過0.75mL的上清轉移到新離心管中。有時候上清液中還會有少量細小懸浮物，但對后續操作沒有影響，不必進行特殊處理。

6.在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻，溶液將呈白色混濁狀。

7. 將其置于冰浴中放置5-10分鐘。

8. 12000～15000g室溫離心3分鐘，轉移上清到新的1.5mL塑料離心管中。

9. 加入0.2mL的氯仿(自備)，震蕩器上充分振蕩30秒混勻。

10. 12000～15000g室溫離心3分鐘，兩相交界面將有白色膜狀物，小心轉移上清到新1.5-5mL塑料離心管中。注意：由于下一步要加1.5倍體積的溶液C，所以新的離心管的體積要足夠大。

11. 加入1.5倍體積的溶液C，上下顛倒30秒混勻，然后分多次的將混合液轉移到離心吸附柱中。

12. 每次轉移0.7-0.8mL 混合液后，室溫放置5-10分鐘。

13. 12000～15000g室溫1分鐘，棄穿透液。

14. 對需要多次上柱的樣品，可以在此將剩余的樣品加到離心吸附柱式中，重復第12-14 步的操作。

15. 將0.7mL 通用洗柱液加入離心柱，室溫離心1分鐘，棄穿透液。

16.在離心吸附柱中加入0.3mL的通用洗柱液，12000～15000g離心半分鐘(此步為第二次洗滌)。

17. 空甩1分鐘去除殘留液體。

18. 將離心柱放置在一新的1.5mL塑料離心管中，加入30-100μL DNA 洗脫液2.0。

19.室溫放置5分鐘后離心1分鐘，管底即為軟體動物DNA溶液，可立即使用，也可長期保存在－20℃。
20.可以重復上步一次，以洗脫更多的DNA(第二次洗脫的DNA一般有第一次的30%左右)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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