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本試劑盒適用于從新鮮或冷凍的小鼠或大鼠鼠尾中提取高純度的總DNA。該試劑盒提供的方法簡單易行，純化過程無需苯酚或氯仿抽提，可獲得最大為50kb的DNA片段，同時對100bp的片段也能有效回收。本試劑盒采用獨特的裂解液，有效裂解鼠尾樣本，優化的緩沖體系使裂解鼠尾后產生的DNA高效結合到硅基質吸附柱上，而其他污染物可流過膜；PCR和其他酶促反應的抑制劑可通過兩步洗滌步驟被有效去除，最后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可得到高純度的DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構建、Southern Blot、分子標記等下游實驗。

自備試劑：無水乙醇

產品特點

1、專用于從大鼠或小鼠的鼠尾中分離純化高純度總DNA。

2、無需有機溶劑提取以及乙醇沉淀，徹底去除污染物及下游反應抑制物，快速提取高品質DNA。

實驗前準備及重要注意事項：

1、向蛋白酶K中加入1.25mL蛋白酶K儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K勿長時間室溫放置，避免反復凍融，以免影響其活性。

2、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量下降。

3、第一次使用前應按照試劑瓶標簽說明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

4、使用前請檢查Buffer GL是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GL于56℃水浴重新溶解。

操作步驟：

1、取一段大鼠或兩段小鼠長度為0.4-0.6cm的尾巴，在液氮中研磨成細粉或剪碎放入離心管(自備)中。加入180μL Buffer GTT，振蕩混勻。

注意：確保組織的起始量不要超出推薦范圍。

2、加入20μL蛋白酶K，渦旋振蕩，徹底混勻。

3、置于56℃水浴，直至組織溶液完全清澈，一般情況下需要消化6～8小時，孵育過程中渦旋震蕩，使樣品均勻分散。

注意：1)如果孵育和渦旋震蕩后仍然有膠狀物質，必要時過夜消化或再加入20μL蛋白酶K消化，不會影響后續操作。

2)如需去除RNA，在上述步驟完成后加入4μL 100mg/ml的RNase A溶液，震蕩混勻，室溫放置5～10分鐘。

4、12000rpm(~～13400×g)離心1分鐘，以除掉未消化的類似于鼠毛等組織。將上清轉移到一個新的離心管(自備)中。

5、加入200μL Buffer GL，渦旋震蕩，充分混勻。加入200μL無水乙醇，渦旋震蕩，充分混勻。短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1)加入Buffer GL和無水乙醇后要立即渦旋震蕩混勻。

2)如果多個樣品一起操作，Buffer GL和無水乙醇可以等比例混勻后一起加入樣品。

3)加入Buffer GL和無水乙醇后可能會產生白色沉淀，不會影響后續實驗。

6、將步驟5中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中，若一次不能加完溶液，可分多次轉入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需進一步提高DNA純度，可重復步驟8。

9、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步目的是將吸附柱中殘余乙醇去除，乙醇殘留會影響后續酶促反應(酶切、PCR等)。

10、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-200μlBuffer GE或滅菌水，室溫放置2～5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游實驗對pH值或EDTA敏感，可以用滅菌水洗脫。洗脫液的pH值對洗脫效率有很大影響，若用水做洗脫液應保證其pH值在7.0～8.5(可以用NaOH將水的pH值調到此范圍)，pH值低于7.0時洗脫效率不高。

2)離心之前室溫孵育5分鐘可以增加產量。

3)用另外的50～200μL Buffer GE或滅菌水再次洗脫可以增加產量。

4)如果要提高DNA的終濃度，可以將步驟10所得的DNA洗脫液重新加至吸附膜上，重復步驟10；若洗脫體積小于200μL，可以增加DNA的終濃度，但可能會減少總產量。如果DNA的量小于1μg，推薦用50μL Buffer GE或滅菌水洗脫。
5)因為保存在水中的DNA會受到酸性水解作用的影響，如需長期保存，推薦用Buffer GE洗脫并于-20℃保存。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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