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基于PCR的中藥分子鑒定方法是辨別中藥真偽，保證藥材質量，促進中藥產業現代化的十分重要的手段。但由于日曬，高溫烘烤等處理極大地破壞了中藥材DNA的完整性；處理過程中多酚多糖及其氧化物也會與DNA發生復雜的化學反應，所以從中藥材中提取可以用于PCR的DNA 比從新鮮植物中提取要困難很多。為解決這一問題，我們公司在植物DNA提取試劑盒產品基礎上開發了本產品。

產品特點：

1.適合于大多數藥材。

2. 得到的DNA 純凈，OD260/280一般都在1.6以上，原液或100倍之內的稀釋液一般都能直接作為PCR 模板。

3. 操作簡單，整個過程只需要三十分鐘左右。

4. 試劑無毒無害，環保衛生。

儲存條件：常溫運輸及保存，有效期一年。

使用方法：

1. 65℃預熱溶液A，待其沉淀溶化后，充分混勻，取0.75mL 加入到10-15mL的塑料離心管中并放置于65℃待用。

2. 稱取20mg左右的中草藥，先剪成或研磨成微小的碎片，然后轉移到預熱的溶液A中勻漿，勻漿過程中將產生大量泡沫，屬于正常現象。也可以液氮研磨后將中草藥粉末加入到預熱的溶液A中(建議不要在陶器或玻璃研缽中研磨，因為其主要成分二氧化硅會非特異地吸附DNA，降低DNA 回收量。但可以在塑料研缽中研磨)。

3. 將勻漿液置于65℃水浴保溫5分鐘，然后全部轉移到新的1.5mL塑料離心管中(此時勻漿液較為粘稠，可將槍頭剪去一截后轉移上清，植物碎片可倒入)。

4. 12000～15000g室溫離心3分鐘，將上清轉移到新的1.5mL塑料離心管中(上清液的體積一般為200-700μl，如果體積超過700μl，多余部分可以不要)。有的上清液中會有少量細小塊狀物，但對后續操作沒有影響，不必進行特殊處理。

5.在上清液中加入等體積的溶液B，上下顛倒30秒充分混勻(溶液將呈白色混濁狀)，然后置冰浴中5分鐘。

6. 12000～15000g室溫離心3分鐘，轉移上清到新離心管中。

7. 加入0.2mL的氯仿(自備)，震蕩器上充分振蕩30秒混勻。

8. 12000～15000g室溫離心3分鐘，兩相交界面將有白色膜狀物。小心轉移上清到新離心管中。

9. 重復氯仿抽提步驟一次，此步可以有效去除含色素物質。

10. 加入0.6-1倍體積的異丙醇(自備)，上下顛倒30秒混勻。

11. 12000～15000g離心5分鐘，棄上清，管底將有微小DNA沉淀。

12.沉淀用75%乙醇清洗2次后，室溫晾干。
13. 加入50-100μl自備緩沖液(如TE)溶解沉淀。DNA 即可用于電泳，酶切和PCR等反應。如果需要測OD，則必須乙醇沉淀去除降解的RNA。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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