產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
柱式真菌DNA提取試劑盒(玻璃珠法)	Fungus DNA Column extraction kit(Glass bead method)	50次	CS-01F99006

真菌DNA提取是一個(gè)難題，一是因?yàn)檎婢芯z體、孢子等多種完全不同的結(jié)構(gòu)形態(tài)，二是因?yàn)槠浼?xì)胞壁一般都很厚，比較難以破碎。本產(chǎn)品是液氮研磨法柱式真菌DNA提取試劑盒的姊妹產(chǎn)品，它利用玻璃珠法破碎細(xì)胞，主要用于從真菌孢子和液體培養(yǎng)的真菌細(xì)胞中提取DNA(液氮研磨法柱式真菌DNA提取試劑盒采用液氮研磨法破碎細(xì)胞，適用于從真菌菌絲體中提取其基因組DNA)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1. 即開即用，提供包括玻璃珠、離心吸附柱在內(nèi)的所有試劑和耗材。

2. 采用玻璃珠法破碎細(xì)胞，屬于物理方法，遠(yuǎn)比基于蝸牛酶或破壁酶的溫和化學(xué)破壁法重復(fù)性好，也不容易帶入外援真菌DNA。

3. 本方法提取一個(gè)樣品只需要10余分鐘，方便、快速和高效。

4.一次可以處理5mL的過夜真菌培養(yǎng)物，所得的基因組DNA OD260/OD280一般都在1.8左右，長度一般在20 kb左右，每mL菌液的DNA產(chǎn)率一般在1-3ug。可以直接用于PCR和酶切等后續(xù)試驗(yàn)。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸及保存，保存期為一年。

使用方法：

1. 對(duì)菌液：取3-5mL過夜培養(yǎng)的真菌菌液(OD600一般在1以上)到干凈的塑料離心管中，12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

2. 對(duì)菌落：用接種針在在培養(yǎng)基上刮取盡可能多的真菌菌落(約50mg)，轉(zhuǎn)移到裝有1mL水的干凈的塑料離心管中，洗滌下接種環(huán)上的菌體。12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

3. 對(duì)孢子材料，一般取0.1g左右，直接加入到離心管中，然后進(jìn)入下一步操作。

4.在材料中加入無菌水1mL，振蕩半分鐘后12000rpm離心2分鐘棄上清留沉淀。

5.沉淀中加入500μl溶液A和0.5克的玻璃珠，渦旋震蕩10分鐘。

6. 加入500μL的溶液B，渦旋震蕩3分鐘，12000rpm離心2分鐘，將上清液全部轉(zhuǎn)移到一個(gè)5mL的干凈的塑料離心管中。或者每管0.3mL，分別轉(zhuǎn)移到2-3個(gè)1.5mL的干凈的塑料離心管中。

7.在上清中加入3倍體積的溶液C，顛倒數(shù)次混勻后，分三次上離心吸附柱，每次上柱后均先室溫放置2分鐘，然后12000rpm離心1分鐘，倒掉穿透液，再第二次上柱，重復(fù)上面的操作，直到掛柱步驟完成。

8.在離心吸附柱中加入500μl通用洗柱液，12000rpm離心1分鐘，倒掉穿透液。

9. 重復(fù)上步操作一次。

10. 12000rpm空柱離心1分鐘。

11. 加入50-100μl DNA洗脫液2.0，室溫放置1分鐘以上，12000rpm離心1分鐘，穿透液即為真菌DNA樣品。

12. 為了得到更多的DNA樣品，可以重復(fù)上步操作1-2次。
13. 所得DNA即可立即使用或放冰箱長期保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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