產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
柱式動(dòng)物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級(jí))	Animal mitochondrial DNA column extraction kit(PCR Grade)	50次	CS-01F99005

介紹線粒體DNA(mtDNA)是進(jìn)行分子進(jìn)化研究和母性遺傳研究的重要材料，但傳統(tǒng)的兩步式mtDNA提取方法是先溫和裂解細(xì)胞，分離線粒體，然后再?gòu)木€粒體中提取mtDNA。此方法中的溫和裂解細(xì)胞的條件十分難以控制，需要針對(duì)不同組織材料單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化。本試劑盒克服了上述缺點(diǎn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡(jiǎn)單快捷。

得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動(dòng)物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體DNA一般都十分巨大，非常難提。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸，短期可以在室溫放置；長(zhǎng)期保存最好放4℃。

使用方法：

一、培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理

用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞，離心收集后棄上清。

用PBS或TBS等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二、組織細(xì)胞預(yù)處理

用剪刀將1g新鮮的動(dòng)物組織剪碎(芝麻大小最好)，轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中，用于mtDNA提取。注意：最好不要使用凍存的動(dòng)物組織，因?yàn)閮瞿^(guò)程中形成的冰晶會(huì)將線粒體刺破，使其DNA釋放出來(lái)被胞漿中的DNA酶降解，影響回收率。

三、血液預(yù)處理

將3～5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘，取白細(xì)胞層。

用自備PBS洗滌白細(xì)胞兩次，得到的白細(xì)胞沉淀用于mtDNA提取。

四、mtDNA提取

在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A，充分吹打分散。如果是剪碎的組織，不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀，用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用)，溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬(wàn)不要?jiǎng)×艺袷帯?/span>

冰上放置6～8分鐘。注意不要超過(guò)8分鐘。

加入350μL冰浴的溶液C，溫和混勻4～6次，可見(jiàn)白色沉淀物產(chǎn)生，然后放冰上放置20～25分鐘。

室溫12000～15000g離心10分鐘，小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大，有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象，取上清時(shí)避開(kāi)漂浮的沉淀即可。

靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合，此步十分重要。

室溫12000～15000g離心1分鐘，棄收集管中的廢液。

加入500μL的通用洗柱液，室溫12000～15000g離心1分鐘，棄收集管中廢液。

注意：通用洗柱液中含乙醇，用后需要將蓋擰緊存放，否則乙醇會(huì)揮發(fā)。

重復(fù)上步1次。

室溫12000～15000g離心1分鐘，甩干殘留液體。此步不能省略，否則殘留乙醇會(huì)影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。

將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管中，加入30～50μL 65～80℃預(yù)熱的DNA洗脫液，室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫，但產(chǎn)量稍微有所降低。

室溫12000～15000g離心1分鐘，離心管底溶液即mtDNA。

由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng)，如果再加30～50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中，往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于第一次洗脫的20～30%)，但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來(lái)洗脫。

12000～15000g離心1分鐘，離心管底溶液即線粒體DNA。每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮，可以使用本公司的核酸濃縮劑。
由于DNA機(jī)械斷裂，電泳時(shí)DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶，但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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