產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
柱式動(dòng)物線粒體DNA提取試劑盒(測(cè)序級(jí))	Animal mitochondrial DNA column extraction kit(Sequencing Grade)	15次	CS-01F99004

介紹線粒體是非常重要的細(xì)胞器，它不但跟很多人類疾病相關(guān)，而且還是母系遺傳研究的重要材料。對(duì)線粒體進(jìn)行遺傳研究和進(jìn)化研究都需要純化線粒體DNA。本產(chǎn)品先純化動(dòng)物細(xì)胞線粒體、再從中純化其DNA。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

即開即用，用戶不需要自己配制各種溶液，優(yōu)化各種條件。

兩步法，先純化線粒體，再柱式法純化其中的DNA，基因組DNA污染少。

本產(chǎn)品可以用15次，一次可以處理約1×108個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞（相當(dāng)于5瓶150mm培養(yǎng)細(xì)胞），可以純化到到0.2～0.5mg線粒體。

適用于各種動(dòng)物懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，不建議用于動(dòng)物實(shí)體組織。

提供線粒體染液，可以在操作中隨時(shí)監(jiān)測(cè)純化過程中線粒體的完整性。

運(yùn)輸及保存：

常溫運(yùn)輸和保存，保存期限一年。其中有3個(gè)成分（見上表）放低溫成分袋，低溫運(yùn)輸，-20℃保存。

自備試劑：

PBS緩沖液、氯仿、0.5M EDTA溶液（pH8.0）。

人TPMT VNTR的上游引物為5 GCT CCG CCC TGC CCA TTT 3，

人TPMT VNTR的下游引物為5 GCC TCC GCC ACC AAT GAC 3，

人線粒體HV2區(qū)的上游引物為5 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C3，

人線粒體HV2區(qū)的下游引物為5 CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A3。

使用方法：

注意：線粒體膜對(duì)溫度高度敏感，所以整個(gè)操作必須在冰上或冷室進(jìn)行，溶液和離心管都需預(yù)冷。

一、準(zhǔn)備工作

未用完的下列溶液需要-20℃保存，否則容易長(zhǎng)菌。下次使用前需溶解沉淀并搖勻。

將50mL溶液A和250mL溶液B放冰上預(yù)冷待用。

配制1.0M低比重溶液100mL:將34克蔗糖用100mL溶液B溶解并放冰上待用。

配制線粒體重懸液100mL:將75mL溶液B和25mL1.0M低比重溶液混合，冰上待用。

二、線粒體粗提

如果提取材料是單層培養(yǎng)細(xì)胞，先用20mL自備的PBS緩沖液洗滌1×108個(gè)培養(yǎng)的單層細(xì)胞，共洗滌2次。然后用塑料刮匙刮下細(xì)胞，重懸在20mL PBS緩沖液中。如果是懸浮細(xì)胞，則1000g 4℃離心10分鐘收集1×108個(gè)細(xì)胞，再用20mL PBS緩沖液洗滌2次，最后將細(xì)胞重懸在20mL PBS緩沖液中。

用平甩轉(zhuǎn)子（swinging-bucket rotor）離心機(jī)1000g 4℃離心10分鐘，棄上清留沉淀。

加入5倍體積(以細(xì)胞沉淀的體積為基數(shù))的預(yù)冷的溶液A，輕柔重懸細(xì)胞。

冰上放置4～5分鐘。注意：冰浴時(shí)間不要超過5分鐘。

如果是成纖維細(xì)胞，由于其難以裂解，可將細(xì)胞重懸液在-80℃放置20～30分鐘后再化凍，然后進(jìn)入下步操作。如果不是成纖維細(xì)胞，則直接進(jìn)入下步操作。

將細(xì)胞重懸液體轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的Dounce玻璃勻漿器中（工作體積為10～15mL，間隙為0.12mm，最好是玻璃材質(zhì)，否則線粒體產(chǎn)率會(huì)降低）勻漿適當(dāng)次數(shù)。細(xì)胞株不同，其最適勻漿次數(shù)不同，一般需要40次～60次左右。勻漿是線粒體純化最關(guān)鍵的步驟，故勻漿前最好先通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最適勻漿次數(shù)，方法是每勻漿5～10次后，取2～3μL勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細(xì)胞數(shù)量降低到20%以下為佳。

加入1/3體積的、預(yù)冷的1.0M低比重溶液，輕柔混勻。

用平甩轉(zhuǎn)子離心機(jī)4℃1000g離心10分鐘。沉淀含殘留完整細(xì)胞、細(xì)胞碎片和細(xì)胞核，上清液含線粒體。

轉(zhuǎn)移上清液到離心管中，冰上放置。在顯微鏡下檢測(cè)上清液中線粒體的完整性。具體做法是先滴50μL左右上清液到載玻片上，再滴入50μL詹納斯染液綠B染色液20分鐘，油鏡下觀察，藍(lán)綠色顆粒狀物即為線粒體。

用固定角度轉(zhuǎn)子（fixed-angle rotor）離心機(jī)4℃15000g離心15分鐘，棄上清，所得棕黑色沉淀即為粗提線粒體沉淀。

用5mL線粒體重懸液重懸線粒體，4℃15000g離心15分鐘，棄上清。

重復(fù)上步一次。

如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)是提取mtDNA用于PCR或Southern雜交，則直接進(jìn)入第4部分mtDNA提取，也可以放-80℃長(zhǎng)期保存待用。如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)是提取mtDNA用于高通量測(cè)序，則必須徹底降解掉其中的細(xì)胞核DNA污染。勻漿過程中一個(gè)破裂的細(xì)胞核釋放出的DNA相當(dāng)于上百萬個(gè)線粒體的DNA量之合，所以無論如何小心，粗提線粒體中必有大量的細(xì)胞核DNA污染，如果不將其清除，高通量測(cè)得的序列將絕大部分來于核DNA而非mtDNA。

三、細(xì)胞核DNA的去除及鑒定

將線粒體重懸于0.3mL預(yù)冷的線粒體重懸液中，取10μL作為未處理線粒體（后面將使用）。

加入6μL Benzonase（1U/uL）溶液和30μL DNase A溶液（配法：將0.5mL 10×DNase A反應(yīng)液加到裝有5mg DNase A干粉的離心管中得到10mg/mL DNase A溶液，未用完的此溶液需要分裝后放-20℃保存）。

37℃保溫一段時(shí)間酶切細(xì)胞核DNA。注意：最好先預(yù)實(shí)驗(yàn)，每隔一段時(shí)間取10μL樣品，滅活其中的DNase后作為模板用PCR擴(kuò)增人基因組TPMT VNTR位點(diǎn)和人mtDNA HV2區(qū)(兩基因的PCR引物見自備試劑)，檢測(cè)不到VNTR基因而能檢測(cè)到mtDNA基因的處理時(shí)間為最佳。相關(guān)引物和PCR試劑需要自備。可用未處理線粒體做對(duì)照。

加入10μL自備的0.5M EDTA溶液（pH8.0）以終止酶反應(yīng)。詹納斯綠B染色并在顯微鏡下檢查線粒體完整性（操作見上）。

4℃10000g離心10分鐘，棄上清。
用1mL的預(yù)冷線粒體重懸液重懸線粒體后，4℃10000g離心10分鐘，棄上清留沉淀。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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