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分枝桿菌屬（Mycobacterium）是一類極為古老的革蘭氏陽性細菌屬，它具有不同于別的細菌的細胞壁結構，其靠近細胞膜的部分是其他革蘭氏陽性細菌都具有的肽聚糖（peptidoglycan）層，該層通過磷酸二酯鍵與分枝酸-阿拉伯半乳糖-肽聚糖復合層（MAPc）共價連接。分枝酸是含70～90個碳原子的枝鏈脂肪酸，位于MAPc的外層，分枝桿菌因此而得名。MAPc層之外為糖化脂質層（glycolipid），它與分枝酸相連，成分主要是磷脂，占細胞壁干重的比例高達60%，所以分枝桿菌疏水性很強，不能使用革蘭氏染色。分枝桿菌細胞壁還含有貫穿整個細胞壁的脂阿拉伯糖甘露聚糖（LAM），它是一種含阿拉伯糖和甘露糖的磷酸化的、不均一混合物，其末段所連接的成分的不同與細菌對巨噬細胞反應的不同密切相關。分枝桿菌細胞壁的上述特點使得用常規方法純化其DNA非常困難。本產品就是為解決這一問題而開發的產品。

產品特點：

操作簡單，客戶不需要準備額外的試劑。

適用于整個分枝桿菌屬。

獲得的基因組DNA足夠進行后續的核酸擴增或酶切處理。PCR檢測靈敏度一般在10-100 CFU/mL樣品。

既可以使用培養的分枝桿菌，也可以使用從痰液、精液、血液、腦脊液等樣品中分離的分枝桿菌。

安全無毒，本試劑盒對人體無害，無腐蝕性和刺激性氣味。

本產品只能用于科研。

自備試劑：

TE緩沖液，氯仿。

使用方法：

注意：文獻報道部分分枝桿菌在DNA提取過程中還有形成菌落的能力，所以任何丟棄的溶液都必須按有傳染性的污染物品對待，并嚴格按有關要求進行消毒處理。

一、培養的分枝桿菌樣品的預處理

刮取培養皿培養的分枝桿菌到0.5mL自備TE緩沖液中。

80℃放置20分鐘以殺滅分枝桿菌。

3000g室溫離心15分鐘，棄上清。

將分枝桿菌沉淀放-20℃冰箱備用或直接進入到第四步的分枝桿菌基因組DNA提取步驟。

二、含分枝桿菌的痰液樣品的預處理

將痰液樣品(0.5mL～2mL)加入到干凈的10mL或15mL塑料離心管中。

加2mL的自備蒸餾水，再加入100mg化痰液干粉，充分混合均勻后室溫放置15～30分鐘。如果痰很濃，可以延長保溫時間30分鐘。

3000g室溫離心15分鐘，棄上清。

將分枝桿菌沉淀放-20℃冰箱備用或直接進入到第四步的分枝桿菌基因組DNA提取步驟。

三、含分枝桿菌的血液樣品的預處理

用自備紅細胞裂解液對血液進行紅細胞裂解處理（可另購本公司紅細胞裂解液產品）。

將得到的白細胞沉淀放-20℃或更低溫度放置10分鐘。

迅速將得到的白細胞沉淀100℃加熱10分鐘。

重復上步的洗滌過程一次。

短暫離心半分鐘。此步不要省略，否則殘留的洗柱液（含乙醇）將會影響DNA電泳、酶切和PCR等反應。

將離心吸附柱轉移到一新的離心管中，加入50μL DNA洗脫液2.0，12000～15000g室溫離心半分鐘，所得溶液即分枝桿菌基因組DNA。
直接取5～10μL電泳檢測DNA，其余放冰箱備用或用于后續反應。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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