產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
GST標(biāo)簽蛋白純化預(yù)裝色譜柱	GST Prepacked chromatographic column	1mL\|5mL\|5×1mL\|5×5mL	CS-01F98917

本制品是GST純化樹脂的預(yù)裝重力流柱，規(guī)格有1mL和5mL的。

GST瓊脂糖純化樹脂是以4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，通過10碳連接，用化學(xué)方法共價結(jié)合了還原型制作而成。GST瓊脂糖純化樹脂與S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽結(jié)合力高，可純化含GST標(biāo)簽的蛋白，以及其他S-轉(zhuǎn)移酶和結(jié)合蛋白。GST標(biāo)簽蛋白非變性的條件下被洗脫，保持蛋白質(zhì)的抗原性和功能。如果想去掉GST標(biāo)簽（一種天然蛋白分子量為26000），可根據(jù)識別特異性位點的蛋白酶進行消化。

GST與的結(jié)合依賴于流速。流量越低，結(jié)合能力越。在上樣和洗脫步驟中，流速也是必須要注意的。

注意事項：

流速是一個影響GST標(biāo)簽蛋白或其他結(jié)合蛋白連接到GST樹脂的重要因素。保持流速降低有利于重組蛋白大程度的連到樹脂上。此外蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)，pH和溫度等因素也可能影響結(jié)合能力。

洗脫時使用液體的體積和次數(shù)根據(jù)蛋白的性質(zhì)而決定。在洗脫時根據(jù)需要加入更高濃度的。如有必要可對流穿、清洗和洗脫液進行SDS-PAGE并結(jié)合Western Blot確定純化GST標(biāo)簽蛋白的效果。

GST檢驗步驟可以用于洗脫時的優(yōu)化或跟蹤GST標(biāo)簽蛋白的純化。

通過測量在280nm處的吸光度可以估算GST標(biāo)記蛋白的濃度。GST標(biāo)簽可以使用轉(zhuǎn)換近似，A280≈1對應(yīng)≈0.5mg/ml。

GST標(biāo)簽蛋白的濃度也可以通過標(biāo)準(zhǔn)顯色法測定（如：Lowry法、BCA法和Bradford法）。如果使用Lowry法或BCA法檢測，樣品必須先用脫鹽柱或?qū)悠吠肝龅?/span>PBS以去除，它可以干擾蛋白質(zhì)的測定。改良型Bradford法和普通型Bradford法及改良型BCA法或非干擾蛋白濃度測定試劑盒可直接用于定量，無需去除。

GST樹脂的重復(fù)使用取決于樣品的天然狀態(tài)以及純化相同的樣品（防止交叉污染）。
如果GST樹脂幾乎已經(jīng)失去結(jié)合能力，這可能是由于沉淀物的堆積、變性或非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)導(dǎo)致的。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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