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蛋白樣品提取液III(2D電泳)

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：50mL
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：蛋白樣品提取液III(2D電泳)現貨供應，價格實惠。

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標簽:蛋白樣品提取液III(2D電泳) 50mL 

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蛋白樣品提取液III(2D電泳)

The Extraction Buffer III and Diluent

50mL

CS-01F98692

概述

蛋白溶解液是2D電泳的關鍵因素之一。尿素作為普遍的離液劑，廣泛應用于蛋白質的溶解和變性。但在溶液中，尿素逐漸和氰酸銨達成一定的平衡，這種趨勢隨著溫度和pH的增加而增加。異氰酸會與蛋白質的N末端、賴、精的氨基以及半胱的巰基發生氨甲酰化反應，并改變蛋白質的等電點。因此在進行2D電泳樣品提取時，采用新鮮的以尿素為基礎的2D電泳樣品提取液，具有重要意義。本系列是以干性尿素、其它非離子和兩性去污試劑為基礎，外加一定體積的水化液構成的2D電泳樣品提取液。使用前在干緩沖液中加入一定體積的水化液即可制備新鮮的樣品提取液，使用方便，大程度保證蛋白不被人為修飾。本系列溶解液對疏水性蛋白質的溶解能力，由弱到，可以根據樣品的特性，選擇使用合適的2D電泳樣品提取緩沖液，同時本系列試劑也可以用于對IPG Strips的水化。

儲存條件：冷藏（2-8℃）

應用

2D電泳

組份
Urea;Thiourea powder;diluent:CHAPS
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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