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抗體去除液(Western)

  • 產品貨號：CS-01F98528
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：100ml
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：抗體去除液(Western)現貨供應，價格實惠。

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標簽:抗體去除液(Western) 100ml 

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抗體去除液(Western)

 

100ml

CS-01F98528

本產品可以對同一張膜進行多次Western Blot檢測。在室溫條件下，將用過的膜浸泡在抗體去除液中30-60分鐘，可在不影響抗原蛋白的情況下清除膜上結合的抗體。隨后，可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗，因而可利用同一張膜進行多次蛋白檢測。適宜從少量樣品多次檢測多種不同蛋白質。采用這方法多次檢測同一張膜上的蛋白，能省去蛋白電泳和膜轉移等費時費力的步驟。

儲存條件：室溫保存

有效期：一年

用途：

清除硝酸纖維素膜或PVDF膜上結合的抗體，不影響抗原蛋白。

使用方法：

1．將膜充分浸泡于適當體積的抗體去除液中，室溫孵育15-30分鐘并不時晃動。孵育時間的長短應根據實驗條件進行優化。洗脫某些抗體需要較長的時間如30-60分鐘。

2．用鑷子取出膜，用自備Western Blot 洗滌緩沖液快速淋洗膜一次，然后用TBST洗膜3次，每次10分鐘。

3．此時膜上抗體已去除膜已經再生。用脫脂奶粉或BSA 封閉一小時，進行下一輪Western Blot實驗。

注意事項：

1．有許多因素影響抗體從膜洗脫，如膜類型、抗體類型和濃度及其與抗原結合特性。因此需要優化抗體去除液中孵育膜的時間。

2．確定膜上抗體是否去除與優化抗體去除液孵育膜的時間：用ECL 工作液孵育再生后的膜約1分鐘，然后進行X 光膠片曝光并顯影，可確定膜上的抗體是否完全去除。如膠片上顯示條帶，表明抗體未完全去除，應繼續將膜浸泡在抗體去除液中另外孵育30-60分鐘。然后再次ECL檢查膜上抗體是否去除。重復此步驟直到抗體完全去除并確定佳孵育時間。

3．使用脫脂奶粉封閉的膜要比使用BSA 封閉的膜上的抗體更容易被去除下來。因此準備進行再生的膜，應該使用脫脂奶粉而不是BSA 封閉。

4．盡量避免使用干燥保存的膜，干的膜上的抗體很難被去除干凈。

5．PVDF膜上使用的效果好于硝酸纖維素膜。6．使用非化學發光試劑進行的Western檢測，例如DAB，NBT/BCIP，不適用于本試劑。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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