產(chǎn)品目錄

在WB和ELISA 實(shí)驗(yàn)中，需要用封閉試劑將膜或酶標(biāo)板孔中的未被抗原或抗體占據(jù)的位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)行封閉，通常的封閉試劑有BSA，脫脂奶粉等，但是BSA中有少量的抗體殘留，導(dǎo)致抗原/抗體之間的交叉反應(yīng)，產(chǎn)生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高，同樣脫脂奶粉中含有少量的和堿性磷酸酶殘留，在使用-親和素系統(tǒng)和堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗時，也會使得高背景或本底水平增高，脫脂奶粉中含有的酪蛋白和堿性磷酸酶殘留也使得其不適用于磷酸化蛋白的檢測。

無蛋白封閉液產(chǎn)品采用化學(xué)合成的高分子聚合物，作為封閉試劑，從而避免了BSA，脫脂奶粉作為封閉試劑的缺陷，使得實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更加精確，膜上的條帶更加清晰，同時也不降低免疫印跡反應(yīng)的靈敏度。

儲存條件：2-8℃保存。

有效期：一年。

注意事項(xiàng)：

● 背景非常高的抗體，可以4℃封閉過夜。

使用方法：

1．WB 實(shí)驗(yàn)時，將封閉液加入到合適的含有膜的容器中，將膜完全浸沒，在室溫或37℃條件下，震蕩1-2小時。

2．ELISA 實(shí)驗(yàn)中，將200μL封閉液加入到酶標(biāo)板的每個孔中在室溫或37℃條件下，震蕩1-2小時。
3．按照Western blot和ELISA 實(shí)驗(yàn)的要求，繼續(xù)進(jìn)行洗滌或甩板，一抗，二抗的加入，洗滌，顯色或發(fā)光等其他實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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