產(chǎn)品目錄

在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物，Folin-酚試劑中的磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽被復(fù)合物蛋白質(zhì)中的酪和苯丙殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色，在一定的條件下，藍(lán)色深度與蛋白的量成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。

儲(chǔ)存條件：試劑A、B和Folin-Ciocalteu試劑4℃保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)-20℃保存。

有效期：一年。

使用方法：

A、96孔酶標(biāo)板測(cè)定：

1．工作液C配制。根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積試劑A加1體積試劑B(50:1)配制適量工作液C，充分混勻。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

3．加入Folin-Ciocalteu試劑振蕩混勻后，室溫放置30分鐘。

4．用酶標(biāo)儀測(cè)定A750，以不含BSA的光吸收值為空白對(duì)照。

5．以蛋白含量(μg)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6．樣品測(cè)定：將待測(cè)蛋白樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，取20μl樣品，加入200μl 工作液C，混勻后室溫放置10分鐘，然后加入20μl Folin-Ciocalteu試劑，混勻后室溫放置30分鐘。

7．以 0 號(hào)孔為對(duì)照，測(cè)定樣品吸收值A750。

8．根據(jù)測(cè)得的吸收值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得樣品的蛋白含量。

9．計(jì)算蛋白濃度：以查得的蛋白含量除以樣品體積20μl，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得到待測(cè)樣品的實(shí)際濃度。

B．比色皿測(cè)定
按照比色皿規(guī)格，與以上方法相同，適當(dāng)按比例增加各溶液體積即可。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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