產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
雙組分TMB顯色液	TMB Two-Component Substrate solution(for Elisa)	50ml2\|100ml2\|250ml2\|500ml2	CS-01F98288

目前酶免疫分析(EIA)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于抗原，半抗原或抗體的定量或定性檢測(cè)分析。辣根過氧化物酶(HRP)及其偶聯(lián)物是酶聯(lián)免疫分析技術(shù)中常用的一種酶，由于3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在HRP的顯色反應(yīng)體系中，比其它色原具有更高的靈敏度且無致癌性而被廣泛應(yīng)用。TMB主要應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，免疫斑點(diǎn)雜交或者免疫組化以及氯和過氧化氫的檢測(cè)分析。為了滿足不同的試劑盒產(chǎn)品研發(fā)與生產(chǎn)以及科研需求，本公司專門研制了針對(duì)不同類型的基于HRP的免疫分析用TMB顯色液。

外觀與結(jié)構(gòu)：顯色液A應(yīng)為無色或淡黃色透明液體，顯色液B應(yīng)為無色透明液體。均無沉淀、顆粒及絮狀物。

用于酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)中的顯色階段：可于樣本反應(yīng)，生成深藍(lán)色產(chǎn)物。

使用方法：

1、加液：待樣品孔中加完HRP結(jié)合物并孵育一定時(shí)間后，用適當(dāng)洗滌液洗板3-5次，每孔加底物顯色液A、顯色液B各50ul(A、B液先混合再加入孔中)，輕輕混勻，根據(jù)個(gè)人實(shí)驗(yàn)需要，在室溫(15～25℃)或37℃下避光溫育10～30分鐘或更長時(shí)間，直至顯色至預(yù)期深淺。

2、終止：每孔加入等體積的1M 鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)，孔中反應(yīng)液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

3、讀數(shù)：終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)在450nm處測(cè)定各孔溶液的吸光值。

4、對(duì)照：空白對(duì)照不加HRP標(biāo)記的抗體/抗原和陰性對(duì)照結(jié)果應(yīng)無色。陽性對(duì)照及加HRP標(biāo)記的抗體/抗原產(chǎn)生深藍(lán)色產(chǎn)物。

注意：如果出現(xiàn)高的反應(yīng)背景或沉淀，表明TMB底物反應(yīng)過于烈。為了避免產(chǎn)生沉淀，可在終止后馬上讀數(shù);或者進(jìn)一步稀釋一抗和/或HRP結(jié)合物。
儲(chǔ)存條件：2～8℃避光，有效期1年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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