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全蛋白提取試劑盒(中)

  • 產品貨號：CS-01F98242
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • CAS號：
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  • 含量：50T|100T
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：全蛋白提取試劑盒(中)現貨供應，價格實惠。

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標簽:全蛋白提取試劑盒(中) 50T 100T 

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全蛋白提取試劑盒(中)

 

50T|100T

CS-01F98242

全蛋白提取試劑盒(中)用于哺乳動物組織和細胞中提取總蛋白，試劑盒中的裂解液含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，作用較為溫和，可快速獲得總蛋白，可用于免疫印跡實驗等基礎研究實驗，由于含有上述的酶抑制劑，不能用于研究蛋白激酶和磷酸激酶的研究。

操作方法:

1、組織總蛋白的提取

(1)在1ml的冷裂解液中各加入10ul的磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF;混勻，放置在冰上備用;

(2)稱取0.1g的新鮮組織，放置于玻璃勻漿器的入口緩沖處，用眼科剪將組織塊盡可能的剪碎，然后加入0.5～1ml的新配置的裂解液，研磨直至沒有明顯的組織塊，這個過程注意冰上操作;

(3)將組織勻漿液移入1.5ml的EP管中，4℃12000g離心30min;

(4)吸取上清至新的管中;

(5)進行蛋白定量或者變性進行蛋白實驗。

(提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復凍融，避免長時間儲存。)

2、細胞總蛋白的提取

(1)裂解液的用量：107個細胞需要裂解液1ml;

(2)貼壁細胞：棄去培養基，用冷的PBS洗兩次，棄去PBS，然后加入計算好的細胞裂解液;在冰上用細胞刮刀進行刮離細胞，將刮離的細胞裂解液移入EP管中，顛倒裂解20-30min

(3)懸浮細胞：4℃,400g離心收集細胞，用冷的PBS洗兩次細胞，同樣按細胞數加入裂解液，渦旋10s，放置冰上裂解10min，重復3～4次;

(4)裂解完畢之后，將細胞裂解液4℃12000g離心30min;

(5)將上清移入新的EP管中;

(6)進行蛋白定量或者變性進行蛋白實驗。

(提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復凍融，避免長時間儲存。)

注意事項：

1、實驗過程，所有試劑都要需要預冷或者即融，保證操作過程中的低溫環境;

2、PSMF(有毒)現用現加，因為PMSF在水溶液中會快速降解;
儲存條件 ：-20℃
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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