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全蛋白提取試劑盒()用于哺乳動(dòng)物組織和細(xì)胞中提取總蛋白，試劑盒中的裂解液含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，作用較為烈，可快速獲得總蛋白，可用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)，由于含有上述的酶抑制劑，不能用于研究蛋白激酶和磷酸激酶的研究。

操作方法:

1、組織總蛋白的提取

(1)在1ml的冷裂解液中各加入10ul的磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF;混勻，放置在冰上備用;

(2)稱取0.1g的新鮮組織，放置于玻璃勻漿器的入口緩沖處，用眼科剪將組織塊盡可能的剪碎，然后加入0.5-1ml的新配置的裂解液，研磨直至沒(méi)有明顯的組織塊，這個(gè)過(guò)程注意冰上操作;

(3)將組織勻漿液移入1.5ml的EP管中，4℃12000g離心30min;

(4)吸取上清至新的管中;

(5)進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。

(提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復(fù)凍融，避免長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。)

2、細(xì)胞總蛋白的提取

裂解液的用量：107個(gè)細(xì)胞需要裂解液1ml;

貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，用冷的PBS洗兩次，棄去PBS，然后加入計(jì)算好的細(xì)胞裂解液;在冰上用細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮離細(xì)胞，

將刮離的細(xì)胞裂解液移入EP管中，顛倒裂解20-30min

懸浮細(xì)胞：4℃400g離心收集細(xì)胞，用冷的PBS洗兩次細(xì)胞，同樣按細(xì)胞數(shù)加入裂解液，

渦旋10s，放置冰上裂解10min，重復(fù)3-4次;

裂解完畢之后，將細(xì)胞裂解液4℃12000g離心30min;

將上清移入新的EP管中;

進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。

(提取好的蛋白建議保存于-80℃，即用即取，避免反復(fù)凍融，避免長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存。)

注意事項(xiàng)：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程，所有試劑都要需要預(yù)冷或者即融，保證操作過(guò)程中的低溫環(huán)境;

PSMF(有毒)現(xiàn)用現(xiàn)加，因?yàn)?/span>PMSF在水溶液中會(huì)快速降解;
儲(chǔ)存條件：-20℃

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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