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重組煙草蝕紋病毒蛋白酶

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  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：1000U
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：重組煙草蝕紋病毒蛋白酶現貨供應，價格實惠。

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標簽:重組煙草蝕紋病毒蛋白酶 1000U 

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重組煙草蝕紋病毒蛋白酶

rTEV Protease

1000U

CS-01F98219

重組型TEV蛋白酶（rTEV）是經過基因工程改造和純化后的重組蛋白酶，不僅保持天然TEV酶的功能活性，且在廣譜的溫度范圍內表現出更好的穩定性和特異性。rTEV是一種用來切除融合蛋白上親和標簽的常用工具酶，具有很的位點特異性，嚴格識別七氨基酸序列EXXYXQ↓(G/S)，切割位點在和甘/絲之間。普遍應用的七氨基酸序列為：Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓-Gly。rTEV在pH7.0，30℃時可達到佳活性，但在pH6.0-8.5和溫度4-30℃的廣泛范圍內皆有活性（見表1），使得反應條件的選擇可根據目的蛋白的情況而靈活變動。另外rTEV切割后也能利用其N端的6×His標簽，通過Ni-NTA樹脂去除，以達到純化目的蛋白的目的。

影響天然TEV酶活性的常見因素：1）PMSF和AEBSF（1mM），TLCK（1mM），Bestatin（1mg/ml）、Pestatin A（1mM），EDTA（1mM）以及E-64（3mg/ml），以上這些蛋白酶抑制劑對rTEV的活性沒有影響；2）Zn離子（＞5mM）對rTEV活性有抑制；3）與半胱反應的試劑也是rTEV的潛在抑制劑。

來源：大腸桿菌

外觀：無色透明液體

比活力：5U/μl

活性定義：在1×rTEV Buffer（50mM Tris，pH8.0，0.5mMEDTA，1mMDTT）中，30℃反應1h，剪切>85%的3μg底物所需要的酶量定義為一個活性單位。

純化（Purification）：Ni親和純化

純度：≥95%（by SDS-PAGE）

產品組份：

rTEV Protease（5U/μl）—————200μl

rTEV Buffer 1（20×）——————2ml

rTEV Buffer 2（1000×）—————50μl
儲存條件：-20℃，有效期一年。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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