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我司提供的人源氧化低密度脂蛋白（Human Oxidized Low Density Lipoprotein，Ox-LDL），是由過度銅離子介導(dǎo)人血漿來源的LDL進(jìn)行的氧化修飾。新鮮血漿經(jīng)檢測(cè)為HCV，HBsAg和HIV陰性。本產(chǎn)品為無菌包裝，可以直接稀釋使用。本Ox-LDL廣泛用于脂質(zhì)代謝的研究。另外我們還提供High Ox-LDL可產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，能夠用來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并建立細(xì)胞損傷模型。除提供Ox-LDL，我們還提供人源乙酰化LDL（Ac-LDL），以及熒光標(biāo)記的LDL。

LDL是由極低密度脂蛋白（VLDL）轉(zhuǎn)變而來，主要功能是把運(yùn)輸?shù)饺砀魈幖?xì)胞，運(yùn)輸?shù)胶铣伤幔淇捎糜谘芯渴荏w介導(dǎo)的內(nèi)吞作用過程，尤其是在動(dòng)脈粥樣硬化等疾病中，其血漿來源的LDL可用于研究LDL在功能和代謝中的氧化作用。

氧化的LDL（Ox-LDL）是修飾LDL中的一類。修飾的LDL除包括氧化修飾的LDL外，還包括乙酰化LDL及丙二醛（MDA）、4-羥烯酸（4-HNE）直接結(jié)合的LDL，這些未經(jīng)氧化修飾而僅經(jīng)一般化學(xué)修飾的LDL稱為衍化的LDL。不同于衍化的LDL，Ox-LDL的生理學(xué)獨(dú)特性表現(xiàn)在：1）在細(xì)胞生理功能影響上，Ox-LDL可誘發(fā)細(xì)胞毒性作用，影響花生四烯酸的代謝，抑制酯化作用等，但衍化的LDL無上述效應(yīng)；2）Ox-LDL消耗LDL內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，使LDL上的含量下降，而MDA-LDL無上述效應(yīng)；3）氧化修飾涉及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，LDL中的PUFAs被氧化。MDA對(duì)LDL修飾，是直接和ApoB-100結(jié)合成希夫氏堿，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)輕微；4）氧化LDL在氧化程度低時(shí)，ApoB降解；在氧化程度高時(shí)，ApoB又可發(fā)生再聚合。MDA對(duì)LDL的修飾，ApoB無降解、聚合反應(yīng)發(fā)生；5）Ox-LDL產(chǎn)生的熒光峰波長(zhǎng)為430nm，而MDA -LDL的熒光峰波長(zhǎng)為460nm。Ox-LDL不經(jīng)LDL受體代謝，由清道夫受體識(shí)別、結(jié)合、內(nèi)吞飲入細(xì)胞并喪失正常的代謝途徑，引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，泡沫樣變。

LDL氧化修飾的方式有很多種，常見的有：1）細(xì)胞介導(dǎo)的LDL氧化修飾，又稱為生物氧化修飾的LDL。如內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞都具有此功能；2）過度金屬離子介導(dǎo)的LDL氧化修飾，如Ca2+，Fe2+等；還有其他形式的氧化修飾，包括物理方法如紫外線，或過氧化物酶催化。

蛋白純度：＞97%（瓊脂糖凝膠電泳）

蛋白濃度：1.0～3.9mg/ml（Lowry法）

外觀：無色乳狀液體

緩沖液配方（Buffer Formulation）：＜0.1μM EDTA-Na2in PBS,pH7.4

氧化程度（Oxidized Ratio）：TBARS檢測(cè)（根據(jù)MDA的含量反映LDL的氧化程度）

起始LDL：0.1~0.5nmol MDA/mg蛋白

Ox-LDL：20~26nmol MDA/mg蛋白
儲(chǔ)存條件：4℃，建議避光，有效期6周

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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