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端粒是真核生物染色體末端特殊的DNA-蛋白結(jié)構(gòu)，含多個(gè)重復(fù)序列（5’-TTAGGG-3’），端粒結(jié)構(gòu)的形成和功能的維持需要端粒結(jié)合蛋白的直接或間接參與。端粒酶是細(xì)胞體內(nèi)一種核糖核蛋白復(fù)合體，是由RNA 和蛋白質(zhì)亞基組成的一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，其可以利用自身的RNA 模板合成末端DNA，并添加到染色體末端以克服末端序列的丟失，從而使細(xì)胞獲得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亞基（TERT 或TRT）具有反轉(zhuǎn)錄酶的主要特征，其表達(dá)在正常細(xì)胞中受到抑制，研究表明，TERT或TRT 的表達(dá)與端粒酶活性的表達(dá)一致，與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。Wisman 等在人卵巢癌中利用逆轉(zhuǎn)錄PCR 檢測(cè)hTERT 的mRNA 的表達(dá)，并采用TRAP 法檢測(cè)端粒酶活性，結(jié)果證實(shí)二者均存在于惡性腫瘤中并且表達(dá)模式相同?；谏鲜鲈?，我司實(shí)時(shí)熒光定量PCR 端粒酶檢測(cè)試劑盒通過檢測(cè)TERT 的mRNA 表達(dá)水平來間接反應(yīng)端粒酶的活性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green Real-time PCR）方法以其的快速性及定量性被廣泛應(yīng)用于科研領(lǐng)域，使用本試劑盒可以準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地進(jìn)行mRNA 的表達(dá)分析。試劑盒采用SYBR Green qPCR Master Mix 為熒光實(shí)時(shí)定量PCR 和Two-Step 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 設(shè)計(jì)的優(yōu)反應(yīng)體系，并結(jié)合特異性的細(xì)胞端粒酶催化亞基基因TERT 引物，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟和提高實(shí)驗(yàn)效率。Master Mix 含有Maxima Hot Start Taq DNA 聚合酶、dNTPS、進(jìn)行優(yōu)化處理的PCR 反應(yīng)緩沖液以及SYBR Green 染料。使用Hot Start Taq DNA 聚合酶，為PCR 反應(yīng)提供了更高的產(chǎn)量和靈敏度、特異性，能夠檢測(cè)低至10 個(gè)拷貝的目的基因。
本試劑盒可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)細(xì)胞基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量、檢測(cè)，重復(fù)性好，可信度高。只需加入樣品DNA 模板，反應(yīng)即可進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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