產(chǎn)品目錄

考馬斯亮藍(lán)是兩種相似三苯甲烷染料的總稱，有G250和R250兩種，結(jié)構(gòu)上前者比后者多了2個(gè)甲基，命名上“G”為Green 的縮寫，因G250的藍(lán)色染料泛淺綠色；命名上“R”為Red的縮寫，因R250的藍(lán)色染料呈微紅色調(diào)；“250”表示考馬斯亮藍(lán)的純度。生化實(shí)驗(yàn)中常將考馬斯亮藍(lán)用于蛋白定量和蛋白電泳中蛋白染色。工作原理是：通過與蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基和羧基基團(tuán)間的靜電結(jié)合作用以及范德華力，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)形成但非共價(jià)鍵連接的復(fù)合物。蛋白-染料復(fù)合物的形成穩(wěn)定染料攜帶的負(fù)電荷陰離子（如磺酸基），從而產(chǎn)生在膜上或者膠上肉眼可見的藍(lán)色。

考馬斯亮藍(lán)R250更多用于電泳蛋白的染色，染色靈敏度比氨基黑高5倍，可達(dá)0.1µg蛋白。但是染色背景比較深，需要褪色后才能進(jìn)行蛋白條帶的觀察。考馬斯亮藍(lán)G250對蛋白膠染色的靈敏度相對較差，低檢測到0.5µg蛋白。但是因其在三氯乙酸中不溶而以膠體形式存在，選擇性的和蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，染色迅速，著色深的蛋白質(zhì)條帶數(shù)秒內(nèi)可以顯現(xiàn)出來，約45min后著色深。而且染色背景低，不需要脫色即可進(jìn)行蛋白條帶的觀察。因此，非常適合對電泳凝膠蛋白的快速定性分析。

考馬斯亮藍(lán)G250較多的用于溶液體系中蛋白的定量分析，即 Bradford蛋白結(jié)合檢測法（Bradford protein-binding assay），此方法利用的就是G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，Bradford試劑（也就是酸化的G250溶液）為陽離子，主要為雙質(zhì)子化，溶液為紅色，其大吸收波長（Amax）為470 nm。當(dāng)與蛋白穩(wěn)定結(jié)合后，G250以陽離子，非質(zhì)子化的形式存在，溶液變?yōu)樗{(lán)色，大吸收波長遷移到595 nm。藍(lán)色陽離子形式染料的量與樣本中蛋白的量成正比，因此通過直接測定595nm的吸光度來反映蛋白量。此法的優(yōu)點(diǎn)在于G250與蛋白質(zhì)結(jié)合所需的時(shí)間較短（約2min左右），且結(jié)合的G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物室溫下約1h內(nèi)保持穩(wěn)定。反應(yīng)靈敏度高，是一種非常常用的微量蛋白快速定量方法。

產(chǎn)品性質(zhì)：

中文別名：酸性藍(lán)90；考馬斯亮藍(lán)G；康美賽藍(lán)G250

英文別名：Acid blue 90 Coomassie Brilliant Blue G

CAS：6104-58-1

分子式：C47H48N3NaO7S2

分子量：854.02

外觀：藍(lán)色至紅色結(jié)晶粉末

溶解性：微溶于水，好先溶于甲醇或者乙醇。
儲存條件：室溫

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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