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EBSF，英文名4-(2-Aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride hydrochloride，中文名4-2-胺乙基苯磺酰氟鹽酸鹽，是一種水溶性，不可逆的絲蛋白酶抑制劑，廣譜抑制、糜蛋白酶、纖溶酶、和凝血酶活性。高產品蛋白純化過程中往往需要蛋白酶抑制劑來預防蛋白降解，并提高蛋白制劑的純度。AEBSF是傳統(tǒng)蛋白酶抑制劑PMSF和DFP的替代物，因其毒性低，水溶性，但水溶液穩(wěn)定性更好。另外，AEBSF的抑制常數(shù)類似于 PMSF和DFP，且LD50（依小鼠的口服劑量）高于PMSF和DFP。近期報道發(fā)現(xiàn)AEBSF可以延長急性弓形蟲感染小鼠的壽命，且在SNU-16人胃腺癌細胞中抑制TNF-α誘導的所有凋亡特征。

AEBSF已用于細胞培養(yǎng)及下游純化，使用濃度可達 0.25 mM，推薦使用濃度為0.1-1 mM。

中文別名：4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽；;4-(2-氨基乙基)氟苯磺酰鹽酸鹽

英文別名：AEBSF HCL; PEFABLOC SC;4-(2-Aminoethyl)benz;

分子式：C8H10FNO2S.HCl

分子量：239.7

CAS：30827-99-7

純度：≥98%

外觀：白色或灰白色結晶

熔點：180～182℃

溶解性：溶于水（50mg/ml），DMSO（50mg/ml）

結構式：

注意事項

1）AEBSF可誘導蛋白修飾，例如，可能影響蛋白的等電點。

2）AEBSF水溶液呈微弱酸性，4℃保持可維持其抑制活性高達6個月。而pH高于7.0水溶液穩(wěn)定很弱。

3）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
儲存條件：-20℃，有效期三年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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