產(chǎn)品目錄

DAB是HRP的常用底物，在辣根過氧化物酶的催化下，DAB會產(chǎn)生不溶于水和乙醇的棕色沉淀。該試劑盒適用于HRP系統(tǒng)的的免疫組化中的組織切片、細胞爬片以及Western Blot中PVDF膜、NC膜等的染色。辣根過氧化物酶可以催化底物DAB在目的蛋白所在的位置轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚幕衔铮筛鶕?jù)顏色反應(yīng)來確定目的蛋白的位置及表達情況。

注意事項：

1、工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，配制好的工作液2～8℃避光1小時內(nèi)有效。

2、工作液用量必需充足，保證完全覆蓋組織片或印跡膜。

3、顯色后的組織切片或細胞爬片可用蘇木精或甲基綠復(fù)染。

4、對于組織切片，以每張切片用50μl顯色工作液計算，1ml 20×DAB為400張切片的用量，3ml為1200張切片的用量。

5、為獲得佳實驗結(jié)果，請務(wù)必優(yōu)化實驗條件。

6、顯色后若背景太深，可以考慮延長封閉時間，避免非特異性染色，或者縮短DAB的顯色時間；顯色后若顯色太弱或沒有顯色，可以考慮增加一抗或二抗的濃度，或者適當延長顯色時間。

7、DAB為可疑致癌物，使用時請采取必要的防護措施。

8、本產(chǎn)品僅用于科研，不能用于人體反應(yīng)或人體治療。

操作步驟：

1、DAB顯色工作液配制：根據(jù)需要量，將20×DAB-A和1×DAB-B以1：19的體積比混勻后即為DAB顯色工作液。也可選擇每毫升DAB-B中滴加1滴(約50μl)DAB-A，混勻即可。

2、顯色：

1)印跡膜顯色：將配制好的工作液滴加在印跡膜上(或?qū)⒂≯E膜傾入到DAB工作液中)即可顯色。顯色時間一般為1-5分鐘。顯色完畢后，將膜浸入水中，終止反應(yīng)。

2)組織切片或細胞爬片顯色：加適量的DAB顯色工作液于需要顯色的組織切片或細胞爬片上即可顯色，顯色時間一般為1-5分鐘。顯微鏡下觀察控制顯色時間，當達到佳顯色效果后，自來水沖洗終止顯色。顯色后的切片經(jīng)復(fù)染、脫水透明，封片后可長期保存。
儲存條件：2～8℃

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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