產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
一站式蛋白質(zhì)非變性PAGE電泳套裝(高pH)	One-Stop Protein Native PAGE Pack(A)	30次	CS-01F97978

英文名稱：One-Stop Protein Native PAGE Pack(A)

產(chǎn)品規(guī)格：30次

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native PAGE)是目前電泳法分離活性蛋白的主要方法之一，跟SDS-PAGE根據(jù)分子量大小分離蛋白質(zhì)不同，它是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀、電荷密度三個主要參數(shù)分離蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的pI各不相同，所以對不同蛋白質(zhì)需要選用具有不同pH的電泳體系。單獨配制不同pH的Native PAGE電泳膠十分繁瑣，為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點：

1．即開即用，不需單獨準備各種成分，十分方便。還免去了實驗人員接觸粉末狀的劇毒物品丙烯酰胺

2．非變性，電泳過程中蛋白質(zhì)保持天然的構象和亞基之間的相互作用，得到的蛋白質(zhì)一般都具有生物活性(而SDS-PAGE得到的蛋白沒有活性)。

3．可用于分析蛋白質(zhì)和DNA或RNA的相互作用、蛋白修飾、蛋白構型改變、回收有活性蛋白質(zhì)等試驗。

4．電泳后可直接用于考染、銀染、Western雜交等實驗。

5．提供具有3種不同pH的緩沖液套裝，便于客戶選擇適合的緩沖液體系。
儲存條件：常溫運輸和保存(上樣液需-20℃保存)，保存期為一年。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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