產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
His標(biāo)簽蛋白純化樹脂	GoldBalb His-tag Purification Resin	2mL\|10ml\|100ml\|1L	CS-01F97931

本產(chǎn)品是一種新型的可以兼容還原劑和螯合劑，并能簡(jiǎn)單、快速、高效并且高特異性地純化His標(biāo)簽蛋白的純化介質(zhì)。1mL的GoldBalb His-tag Purification Resin多可純化10～15mg帶有His標(biāo)簽重組蛋白。對(duì)于分子量為50kD的帶有His標(biāo)簽重組蛋白，1mL的GoldBalb His-tag Purification Resin實(shí)際多可純化約3～5mg蛋白。本品儲(chǔ)存在30%乙醇中，每mL中0.5mL為凝膠，0.5mL為液體。使用時(shí)宜把凝膠充分重懸后再吸取。

本產(chǎn)品采用了一種高度交聯(lián)的6%瓊脂糖凝膠(Sepharose CL-6B)為基質(zhì)，并使用了進(jìn)一步優(yōu)化的接臂和鎳離子螯合技術(shù)，和目前市售的大多數(shù)Ni-NTA agarose或類似產(chǎn)品相比，非特異性蛋白結(jié)合顯著降低，耐受壓力，鎳離子螯合非常穩(wěn)定。和同類產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品由于鎳離子基本不會(huì)流失，重復(fù)使用本純化介質(zhì)時(shí)不需要重新裝載鎳離子。

本產(chǎn)品已經(jīng)螯合了鎳離子，呈藍(lán)色，凝膠的顆粒直徑為45～165μm。可耐受的大壓力為0.025MPa，約合5.8psi。采用固定流速進(jìn)行蛋白純化時(shí)的推薦流速為0.5mL/min。

工作原理：

通常帶有6個(gè)組標(biāo)簽的重組蛋白或帶有6個(gè)以上連續(xù)組標(biāo)簽的重組蛋白，被稱為His標(biāo)簽蛋白。蛋白樣品溶液通過GoldBalb His-tag Purification Resin時(shí)，重組蛋白His標(biāo)簽上的組殘基能特異性地結(jié)合到GoldBalb His-tag Purification Resin中的鎳離子上，其它蛋白則不能被結(jié)合。洗滌后，His標(biāo)簽重組蛋白可在非變性條件下被洗脫，從而被分離純化。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本產(chǎn)品對(duì)His標(biāo)簽重組蛋白的親和力、選擇性高。

使用本產(chǎn)品可以獲得高純度的His標(biāo)簽重組蛋白，可用于簡(jiǎn)單、快速、高效地純化細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲及桿狀病毒等多種表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的His標(biāo)簽重組蛋白。純化的蛋白可以用于結(jié)構(gòu)和功能研究、抗體制備、蛋白與蛋白相互作用、蛋白與核酸相互作用等方面的研究。

本產(chǎn)品可以高容量、高特異性地結(jié)合His標(biāo)簽蛋白。

大蛋白結(jié)合量為20～30mg蛋白/mL凝膠。實(shí)際使用時(shí)的大結(jié)合量取決于待純化的His標(biāo)簽重組蛋白的分子量大小，分子量越大則大結(jié)合容量越大，分子量越小則大結(jié)合容量越小。對(duì)于分子量為50kD的蛋白，每mL凝膠的實(shí)際大純化量約為6～10mg，對(duì)于分子量為100kD的蛋白，每mL凝膠的實(shí)際大純化量約為12～20mg。但對(duì)于分子量相同的蛋白，也會(huì)因?yàn)榈鞍妆旧硖匦缘牟煌Y(jié)合的大容量也會(huì)有所不同。

本產(chǎn)品可以很好地耐受DTT等還原劑以及EDTA等螯合劑。

本產(chǎn)品可耐受20mMDTT等還原劑，以及20mMEDTA等螯合劑。這為需要添加還原劑或螯合劑的蛋白樣品的純化提供了可能性。本產(chǎn)品不兼容8M尿素和6M鹽酸胍。對(duì)于包涵體蛋白的純化，在采用8M尿素或6M鹽酸胍溶解蛋白的情況下，需要通過透析去除尿素和鹽酸胍后才能使用本產(chǎn)品進(jìn)行His標(biāo)簽蛋白的純化。
保存：4℃，有效期1年。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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