產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
C43(DE3)pLysS化學感受態(tài)細胞	C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97860

OverExpress C43(DE3)、OverExpress C4l(DE3)兩個菌株均起源于BL2l(DE3)，其優(yōu)點是可以高效表達毒性蛋白或疏水性蛋白。OverExpress C4l(DE3)跟BL21(DE3)的區(qū)別在于其基因組含有至少一個未知突變，這個未知突變使其獲得了高效表達毒性蛋白的能力，此突變位點參與大腸桿菌表達毒性蛋白時的細胞死亡途徑；OverExpress C43(DE3)來源于OverExpress C4l(DE3)，是通過篩選OverExpress C4l(DE3)對另一個不同毒性蛋白的抗性菌株獲得。C43(DE3)菌株具有比C41(DE3)更的表達毒性蛋白和疏水性蛋白的能力。將具有氯抗性的pLysS質(zhì)粒導入C43(DE3)細胞中即是C43(DE3) pLysS,pLysS表達T7，T7可以與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進而降低目的基因的背景表達水平，但不干擾IPTG誘導的表達，非常適合毒性蛋白的原核表達。該菌株染色體整合了入噬菌體DE3區(qū)(DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達。C43(DE3)pLysS感受態(tài)細胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×108cfu/μg DNA。

使用方法：

C43 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒，并用手EP管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰中靜置25分鐘。

42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉(zhuǎn)化效率。

向離心管中加入700 μ1不含抗生素的LB無菌培養(yǎng)液，37℃,200rpm復蘇60分鐘。

5000rpm離心一分鐘收菌，留取50 μ1左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34μg/mL氯雹素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB培養(yǎng)基上。

將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

英文名稱：C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell
產(chǎn)品規(guī)格：10×100μl|50×100μl

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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