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pTG-T載體克隆試劑盒(含感受態細胞)

  • 產品貨號：CS-01F97856
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：226
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：20次|60次
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：pTG-T載體克隆試劑盒(含感受態細胞)現貨供應，價格實惠。

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標簽:pTG-T載體克隆試劑盒(含感受態細胞) 20次 60次 

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pTG-T載體克隆試劑盒(含感受態細胞)

pTG-T Vector Cloning Kit with TOP10 Competent Cells

20次|60次

CS-01F97856

本試劑盒適用于PCR產物的克隆，可將PCR產物連接到pTG-T載體上，便于進行下一步實驗。DNA片段連接是經常出問題的步驟，為了提高連接效率，本試劑盒提供了兩種連接Buffer供不同情況選擇：10×Ligation Buffer Ⅰ適合置于16℃連接過夜，可獲得佳連接效果；2×Ligation Buffer Ⅱ為快速連接Buffer，25℃連接10分鐘即可轉化，快捷方便。

英文名稱：pTG-T Vector Cloning Kit with 0 Competent Cells

產品規格：20次|60次

本試劑盒適用于PCR產物的克隆，可將PCR產物連接到pTG-T載體上，便于進行下一步實驗。DNA片段連接是經常出問題的步驟，為了提高連接效率，本試劑盒提供了兩種連接Buffer供不同情況選擇：10×Ligation Buffer Ⅰ適合置于16℃連接過夜，可獲得佳連接效果；2×Ligation Buffer Ⅱ為快速連接Buffer，25℃連接10分鐘即可轉化，快捷方便。

pTG-T是一種高效克隆PCR產物的專用載體，它是由一種克隆載體在EcoRV酶切位點處切開，在兩側的3′端添加T而成。由于大部分耐熱聚合酶反應時都會在PCR產物的3′端添加一個A，可與pTG-T 3′端的T互補連接，因此可大大提高PCR產物的連接和克隆效率。連接使用的PCR片段3′端應帶有A末端，如果是使用pfu等高保真聚合酶擴增的不帶A末端的片段，應使用平末端連接試劑盒先加A末端后再連接。

試劑盒中配備了高效率的連接試劑、對照用螺旋質粒和0感受態細胞等，可以方便的連接和轉化。帶有插入片段的重組子可根據α互補原理，進行藍白斑篩選，判斷載體中有無外源基因的插入（白色克隆為陽性重組克隆，藍色的為載體自連的克隆，具體篩選原理參考分子克隆等書籍）。克隆后，可使用通用引物T7、SP6進行測序。
保存條件：-20℃保存，避免反復凍融（載體和連接試劑可以適當的分裝成小份，防止反復凍融，以保證質量）。感受態細胞需要嚴格的在-70℃凍存。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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