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pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒

  • 產品貨號：CS-01F97824
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：321
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：1μg|100μg
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒現貨供應，價格實惠。

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標簽:pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒 1μg 100μg 

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pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒

pET-N-GST-Thrombin-C-His Plasmid

1μg|100μg

CS-01F97824

pET-N-GST-Thrombin-C-His是一種用于表達N端含GST標簽(Glutathione S-transferase tag,GST tag)或C端含His標簽(His tag)的重組蛋白的原核表達質粒，也可用于表達N端含GST標簽并且同時C端含His標簽的重組蛋白。GST和His雙標簽有利于通過GST柱和鎳柱兩種方法來純化目的蛋白，使目的蛋白的純度更高。本質粒N端GST標簽后有Thrombin酶切位點，可通過Thrombin蛋白酶切除N端的GST標簽。本質粒為卡那抗性。

本質粒含有T7啟動子/lac操縱子，可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導下高效啟動目的蛋白表達。在多克隆位點的前面有一個GST標簽的編碼序列，后面有一個His標簽的編碼序列，后者含有6個組(6X His)。因此在多克隆位點根據讀碼框插入不含終止密碼子的目的基因就可以表達N端含有GST標簽并且C端含有His標簽的目的蛋白。也可以在目的基因后面添加終止密碼子，這樣就可以表達僅在N端含有GST標簽的目的蛋白。如果在NdeI和多克隆酶切位點之間按照讀碼框插入不帶有終止密碼子的目的基因，這樣就可以表達僅C端帶有His標簽的目的蛋白。

本載體在N端GST標簽與多克隆位點之間含有Thrombin蛋白酶識別的6肽序列LVPRGS，對應的核酸序列為CTGGTTCCGCGTGGATCC，因此在目的蛋白純化后可以利用Thrombin酶切除N端的GST標簽。Thrombin蛋白酶酶切發生在六肽序列的R和G之間，因此在酶切去除GST標簽的時候會在目的蛋白的N端留下兩個額外的氨基酸殘基GS。

通常可以采用如GoldBalb GST-tag Purification Resin(YT958)、GST標簽蛋白純化試劑盒(YT959)、GoldBalb His-tag Purification Resin(YT616)或His標簽蛋白純化試劑盒(YT046)等純化本質粒表達的目的蛋白，也可以使用GST抗體(YT784/YT722)和His-tag抗體(YT789)檢測和少量地分離純化目的蛋白。

使用說明：

1．使用1μg包裝的本產品時，請先取少量本質粒轉化大腸桿菌，進行質粒小量、中量或大量抽提后再用于后續用途。抽提獲得的質粒可以通過酶切電泳進行鑒定，或通過測序進行鑒定。

2．100μg包裝的本產品質粒濃度為0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者轉染細胞。

3．pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒在其多克隆位點適當酶切后可以插入待表達的目的基因，構建的質粒可以用常規方法轉入表達菌株。標簽并且C端含有His標簽的目的蛋白。也可以在目的基因后面添加終止密碼子，這樣就可以表達僅在N端含有GST標簽的目的蛋白。如果在NdeI和多克隆酶切位點之間按照讀碼框插入不帶有終止密碼子的目的基因，這樣就可以表達僅C端帶有His標簽的目的蛋白。

本載體在N端GST標簽與多克隆位點之間含有Thrombin蛋白酶識別的6肽序列LVPRGS，對應的核酸序列為CTGGTTCCGCGTGGATCC，因此在目的蛋白純化后可以利用Thrombin酶切除N端的GST標簽。Thrombin蛋白酶酶切發生在六肽序列的R和G之間，因此在酶切去除GST標簽的時候會在目的蛋白的N端留下兩個額外的氨基酸殘基GS。

通常可以采用如GoldBalb GST-tag Purification Resin(YT958)、GST標簽蛋白純化試劑盒(YT959)、GoldBalb His-tag Purification Resin(YT616)或His標簽蛋白純化試劑盒(YT046)等純化本質粒表達的目的蛋白，也可以使用GST抗體(YT784/YT722)和His-tag抗體(YT789)檢測和少量地分離純化目的蛋白。

使用說明：

1．使用1μg包裝的本產品時，請先取少量本質粒轉化大腸桿菌，進行質粒小量、中量或大量抽提后再用于后續用途。抽提獲得的質粒可以通過酶切電泳進行鑒定，或通過測序進行鑒定。

2．100μg包裝的本產品質粒濃度為0.1μg/μl，共1ml。可以直接用于酶切或者轉染細胞。

 

3．pET-N-GST-Thrombin-C-His質粒在其多克隆位點適當酶切后可以插入待表達的目的基因，構建的質粒可以用常規方法轉入表達菌株。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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