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pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒

  • 產(chǎn)品貨號(hào):CS-01F97822
  • 產(chǎn)品價(jià)格:電議
  • 產(chǎn)品產(chǎn)地:國(guó)產(chǎn)
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購(gòu)熱度:259
  • 庫(kù)存:100
  • CAS號(hào):
  • 方法:
  • 含量:1μg|100μg
  • 品牌名稱:莼試
  • 分子式:
  • 分子量:

簡(jiǎn)介內(nèi)容:pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)?,F(xiàn)貨供應(yīng),價(jià)格實(shí)惠。

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標(biāo)簽:pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒 1μg 100μg 

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貨號(hào)

pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒

pET-Dual-N-GST-PreScission Plasmid

1μg|100μg

CS-01F97822

pET-Dual-N-GST-PreScission是一種用于在大腸桿菌中高效共表達(dá)兩種目的蛋白的質(zhì)粒,其中一種可以帶上GST標(biāo)簽(Glutathione S-transferase tag,GST tag)并且GST標(biāo)簽后有PreScission蛋白酶的酶切位點(diǎn)。本質(zhì)粒包含兩個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS),每個(gè)多克隆位點(diǎn)前都有一個(gè)T7啟動(dòng)子/lac操作子和一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(rbs),因此都可以在異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的誘導(dǎo)下高效啟動(dòng)目的蛋白的表達(dá)。本質(zhì)粒為氨芐青抗性。

在共表達(dá)兩個(gè)蛋白的復(fù)合物時(shí),通常宜把較難表達(dá)的基因克隆到個(gè)多克隆位點(diǎn),宜把較易表達(dá)的基因克隆到個(gè)多克隆位點(diǎn)。這樣通過(guò)GST柱純化,可分離純化獲得帶有GST標(biāo)簽的蛋白復(fù)合物。本質(zhì)粒的NGST標(biāo)簽與個(gè)多克隆位點(diǎn)之間有PreScission蛋白酶識(shí)別的八肽序列LEVLFQGP,對(duì)應(yīng)核酸序列為CTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCC,配合使用我司生產(chǎn)的PreScission Protease4℃酶切過(guò)夜,天收集穿柱液即可獲得蛋白復(fù)合物,這為后續(xù)進(jìn)行蛋白復(fù)合物的功能檢測(cè)、蛋白結(jié)晶等工作帶來(lái)了極大的便利。PreScission蛋白酶酶切發(fā)生在八肽序列的QG之間,因此在酶切去除GST標(biāo)簽的時(shí)候會(huì)在目的蛋白的N端留下兩個(gè)額外的氨基酸殘基GP。當(dāng)然,本質(zhì)粒也可以只在個(gè)多克隆位點(diǎn)插入目的基因,這樣就會(huì)僅表達(dá)一個(gè)含有NGST標(biāo)簽和PreScission識(shí)別位點(diǎn)的目的蛋白。

使用說(shuō)明:

1.使用1μg包裝的本產(chǎn)品時(shí),請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌,進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)??梢酝ㄟ^(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定,或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。

2100μg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1μg/μl,共1ml。可以直接用于酶切或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
3pET-Dual-N-GST-PreScission質(zhì)粒在其多克隆位點(diǎn)適當(dāng)酶切后可以插入待表達(dá)的目的基因,構(gòu)建的質(zhì)??梢杂贸R?guī)方法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株。

實(shí)驗(yàn)步驟:
(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量
(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。
b.單層培養(yǎng)細(xì)胞 直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定,不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。
c.細(xì)胞懸液 離心收集細(xì)胞,每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol,反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研
2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。
3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質(zhì),脂肪,多糖或胞外物質(zhì)(肌肉,植物結(jié)節(jié)部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí),上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機(jī)相,上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中,如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相,進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司

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