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本制品是一種非常高效的基于陽離子脂質體的新型轉染試劑，專門適用于懸浮培養的HEK293細胞，如Freestyle 293-F等，進行質粒轉染和重組蛋白大量表達。本產品與Thermo公司的293fectin Transfection Reagent和Merck公司的293-Free Transfection Reagent的用途和使用效果基本一致，與Thermo公司的Freestyle MAX Reagent相比，用于懸浮培養的293細胞時效果基本一致。

LP293S轉染試劑對Freestyle 293-F細胞的轉染效率非常高(約85%)，同時細胞毒性極低、重復性好、操作簡單、轉染后無需更換培養液。

LP293S轉染試劑也同樣適用于293系列貼壁細胞的轉染，但轉染293系列貼壁細胞時，推薦使用性價比更高的LP293。

LP293S轉染試劑轉染時血清的存在不會影響轉染效率，這樣可以減少避免很多陽離子脂質體因為需要在轉染時去除血清而對細胞造成的損傷。

LP293S轉染試劑毒性極低，轉染后無需更換培養液，一方面細胞的良好生長狀態保證了目的蛋白的大量表達，另一方面又減少了操作步驟并節省了培養液。

LP293S轉染試劑轉染Freestyle 293-F細胞目的蛋白表達質粒后，通常在48-72小時后達到比較理想的蛋白表達水平。

LP293S轉染試劑的轉染效率可以通過轉染表達EGFP等熒光蛋白的質粒進行快速鑒定。

保存條件：

4℃保存。長期不使用可以-20℃保存。-20℃保存后會有沉淀產生，須37℃水浴30min，使完全溶解后才能用于細胞轉染。

注意事項：

使用高純度的DNA有助于獲得較高的轉染效率。對于質粒，可以使用我公司的質粒大量抽提試劑盒(YT003)進行抽提，以保證可以獲得較高的轉染效率。

-20℃等低溫保存后本產品會結凍，溶解時會出現沉淀，此時37℃水浴30min，使完全溶解就可以用于細胞轉染，并且不會影響使用效果。收到的本產品可能會因為干冰等低溫運輸導致溶解后出現沉淀，37℃水浴30min，使完全溶解就可以正常使用了。

轉染前細胞必須處于良好的生長狀態。

需自備不含抗生素的無血清Freestyle 293-F細胞培養液，可以使用SMM 293-T1培養基(M293TI-1)。

LP293S轉染試劑不能vortex或離心，可以用移液器輕輕吹打混勻或緩慢搖動混勻。

LP293S轉染試劑使用后請立即蓋好蓋子，避免長時間暴露在空氣中，影響轉染效率。

本產品對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。
本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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