產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
GT115化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞	GT115 Chemically Competent Cell	10×100μl\|50×100μl	CS-01F97804

GT115菌株，是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)或重復(fù)序列等DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復(fù)合體，可以識(shí)別DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并將其切除；將sbcC和sbcD兩個(gè)基因突變，增了發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的穩(wěn)定性。同時(shí)在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116，使GT115可以表達(dá)π蛋白，含有R6Kg ori復(fù)制子的質(zhì)粒(pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復(fù)制。rpsL賦予GT115鏈抗性，同時(shí)該菌株還含有核酸酶(endA)突變、重組酶(recA)突變，增了外源DNA的穩(wěn)定性。本GT115感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×108 cfu/μg DNA。

基因型：

F- mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15ΔlacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 Δdcm uidA(DMluI)::pir-116ΔsbcC-sbcD

保存：-80℃

使用方法：

感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，待菌塊融化，加入目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手EP管底輕輕混勻（避免用槍吸打），冰中靜置25分鐘。

42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

向離心管中加入700 μ1不含抗生素的無菌SOC或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃,200rpm復(fù)蘇60分鐘。

5000rpm離心一分鐘收菌，留取100 μ1左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的SOC或LB培養(yǎng)基上。
將平板倒置放于37℃培養(yǎng)6.5小時(shí)以上

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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